北大团队｜肿瘤类器官共培养，获取源自TIL的肿瘤特异性 TCR
北大团队｜肿瘤类器官共培养，获取源自TIL的肿瘤特异性 TCR
原创 慕羽 Biotech视界 2024年07月05日 09:20 陕西 5人听过
免疫疗法是癌症治疗的重要方式，T 细胞受体工程化疗法可以在多种实体瘤中诱导强大的抗肿瘤反应。然而，分离肿瘤特异性 TCR 仍然是一项挑战。
目前的方法依赖于预测和使用适当的肿瘤抗原，但预测算法不可靠。此外，只有有限数量的新抗原可以引发免疫反应，并且许多新抗原来自非编码区域。
因此，需要寻找更多的肿瘤抗原来源。肿瘤类器官可以产生天然肿瘤抗原，并被用作刺激体外肿瘤特异性T细胞的扩增的模型。先前的研究表明，结直肠肿瘤类器官可以呈递多样化的 HLA 肽，包括肿瘤特异性抗原。
2024年7月2日，北京大学医学部基础医学院邓宏魁和白云团队，在《Cancer Immunology, Immunotherapy》发表了一篇研究文章，通过与肿瘤类器官的共培养，从结直肠癌患者的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中产生具有肿瘤特异性的 TCRs，并验证了这些 TCRs 的特异性和杀伤能力。
/ 01 /
肿瘤类器官保留了原本肿瘤组织的特征
首先，利用临床CRC患者的肿瘤样本，体外建立PDO。通过组织学评估，发现 PDO 与原始肿瘤组织在形态上相似，呈现出患者特异性的异质形态。在肿瘤类器官中观察到多种类型的细胞，包括潘氏细胞和上皮细胞等。
免疫组织化学染色结果显示，PDO中的染色模式与患者肿瘤组织相似，表明PDO可以重现原始肿瘤组织的组织学和遗传特征。
图1 组织学分析揭示了 PDO 的形态和分子特征
/ 02 /
肿瘤特异性 T 细胞主要存在于 TIL 中
近期研究发现，上皮性癌症患者中存在肿瘤特异性 T 细胞亚群，包括 CD39 + CD103 +、PD-1 + CD8 + 和 CXCL13 + CD8 + T 细胞。
鉴于此，他们分析了 CRC 患者的外周血淋巴细胞（PBL）和 TIL 的 CD39 + CD103 +、PD-1 + CD8 + 和 CXCL13 + CD8 + T 细胞的频率。
图2 CRC 患者外周血淋巴细胞和匹配的肿瘤浸润淋巴细胞的表型分析
结果显示，CD39 + CD103 + CD8 + T 细胞在 TILs 和 PBLs 中均存在，但不同 CRC 患者之间的频率差异较大。在 TILs 中的频率较高（24.9%~43.1%），而在 PBLs 中的频率非常低（0.15%~7.7%）。
PD-1 + CD8 + T 细胞和 CXCL13 + CD8 + T 细胞在 TILs 中的频率分别为23.7%~47.6%和0.81%~2.66%。虽然这4例 CRC 患者的 PBLs 和 TILs 之间没有统计学上的显著差异，但 PBLs 中的频率有降低的趋势。
总的来说，这些结果表明肿瘤特异性 T 细胞主要存在于 TIL 中，在不同的 CRC 患者中表现出很大的异质性。
/ 03 /
类器官-TIL 共培养以产生富含类器官的 T 细胞
为了确定肿瘤类器官是否可以用于富集肿瘤特异性TIL，他们从 CRS 患者肿瘤组织中得到了 PDO 和 TIL 样本。
在将其与自身 TIL 共同培养之前，利用地西他滨（DAC）混合物预处理肿瘤类器官以增强抗原呈递。DAC 可以通过抑制DNA甲基化或促进HLA相关TAP或LMP基因的表达来增加HLA的表达。
图3 富含肿瘤类器官的TIL（oeT）的细胞毒活性
随后，用自身 PDO 刺激 TIL，经过两周共培养获得了图3A中所示的 oeT 细胞，并评估了 oeT 细胞对自身肿瘤 PDO 的反应能力。
结果发现，oeT 细胞在刺激肿瘤 PDO 时能有效诱导IFN-γ的分泌，但对正常PDO没有细胞毒性反应，证明了oeT细胞介导的细胞毒性反应具有肿瘤特异性（图3B）。
为了评估肿瘤类器官对 oeT 细胞的敏感性，他们有共培养了肿瘤和正常类器官与 oeT 细胞，并观察细胞凋亡情况。使用荧光探针来检测活性 caspase-3/7 的存在，并进行成像。
结果显示，仅肿瘤类器官与 oeT 细胞共培养时观察到细胞凋亡的增加，而单独培养或在阻断 MHC 的条件下共培养几乎没有凋亡发生（图3C,D）。
此外，肿瘤类器官中 CD107a 标记的 T 细胞频率也较高。综合来看，这些结果表明 oeT 细胞具有更好的抗肿瘤能力。
/ 04 /
利用 CD137 表达从共培养的oeT 细胞中分离出肿瘤特异性 T 细胞
为了获得肿瘤特异性 T 细胞及其 TCR，他们使用肿瘤 PDO 刺激 oeT 细胞，并使用正常 PDO 和 TIL 作为阴性对照。通过测定 CD137 的上调和 IFN-γ 的分泌，评估 T 细胞反应。
结果显示，与 CRC 患者中的正常 PDO 或 TIL 相比，与肿瘤 PDO 共培养的 oeT 细胞显示了更高数量的 IFN-γ 阳性细胞斑点。
随后，从中分离了单个 CD8 + CD137 + T 细胞，并使用单细胞 PCR 扩增其 TCR 序列。
通过与自体肿瘤类器官共培养来富集 TIL 中的肿瘤特异性 T 细胞
结果发现，肿瘤特异性 TCR 可能是CD8 + CD137 + oeT细胞上最主要的TCR。为了排除非特异性 TCR 扩增的可能性，随后使用正常 PDO 和 TIL 单独刺激的 oeT 细胞作为阴性对照。
流式结果显示，CRC 患者中肿瘤 PDO 组的肿瘤特异性 T 细胞频率明显高于单纯 TIL 组和正常 PDO 组。然而，单纯 TIL 组和正常 PDO 组之间的肿瘤特异性 T 细胞频率差异不大。
/ 05 /
肿瘤特异性TCR-T细胞的构建及功能验证
为了确定oeT细胞是否是肿瘤特异性T细胞的克隆亚群，他们从单独的 TIL 组和与肿瘤 PDO 共培养的 oeT 细胞中分离了 CD8+CD137+ T 细胞并进行了单细胞 RT-TCR 测序。
结果显示，与单独的TIL组相比，肿瘤 PDO 组的 oeT 细胞显示出寡克隆性。在CRC1中，TCR1和TCR2分别占 oeT 细胞群的 25.6% 和 17.8%，而在单独的 TIL 组中分别只占 4.3% 和 3.6%。
肿瘤特异性TCR-T细胞功能验证
类似地，在 CRC2、CRC3 和 CRC4 中，肿瘤 PDO 组的 oeT 细胞中特定的 TCR 频率也明显高于单独的 TIL 组。这表明与肿瘤 PDO 体外共培养后，特定的 TCR 经历了克隆增殖，显示出肿瘤特异性。
随后，对 oeT 细胞中的 TCR Vβ 和 Vα 链进行了测序，并选择了排名前五的链来构建 TCR。为了增强引入的 TCR-T 细胞中的表达，设计了β/α链序列并替换了恒定区，以便在 T 细胞中产生 TCR-T。
通过慢病毒将 TCR 转入健康供体 T 细胞中，然后对这些 T 细胞进行分选，获得了高阳性率。
结果发现，工程化的 TCR-T 细胞对肿瘤 PDO 表现出更高的 IFN-γ 分泌水平和特异性细胞毒性。在其中的 CRC2 中，三种选定的 TCR 显示出可以特异性识别自体肿瘤细胞的能力。
此外，还发现，TCR 对 MHC 的识别具有高度依赖性。这些发现证明，在 oeT 细胞中鉴定的 TCR 能够赋予工程化 TCR-T 细胞对肿瘤的靶向能力。
/ 结语 /
总之，这项研究为癌症治疗领域提供了一种新的技术方法，有助于提高 TCR-T 细胞治疗的靶向性和有效性，特别是在实体肿瘤治疗中。通过使用肿瘤类器官作为抗原来源，该方法能够更准确地模拟肿瘤微环境中的抗原表达，从而提高识别和靶向肿瘤的准确性。
原文连接：
https://link.springer.com/article/10.1007/s00262-024-03749-8#Sec16
END
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2024-07-15 10:41:04 有用(0)
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