生信文献｜单细胞揭秘乳腺癌抗PD1治疗反应异质性

原创 丑柑 丑柑陪你读文献 2023-11-19 22:16 发表于四川

如今，以免疫检查点抑制剂（ICB）为代表的免疫治疗药物在多类肿瘤的治疗中已取得了巨大成功。乳腺癌临床试验数据表明，ICB联合新辅助化疗可提高患者完全缓解率和无事件生存率，而ICB单药的新辅助治疗也有望成为乳腺癌治疗的常规选项之一。但相较于黑色素瘤和肺癌，以抗PD-1/PD-L1抗体为代表的ICB疗法在乳腺癌的治疗中表现尚不尽人意，需进一步研究患者对此类药物缺乏反应的原因并开发预测新辅助治疗获益人群的新方法来指导精准医疗实践。

2021年5月，由来自比利的鲁文大学与浙江大学医学院的研究团队在Nature Medicine发表了题为“A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer”的论著，该研究绘制出乳腺癌患者抗PD1治疗期间肿瘤内变化的单细胞图谱，确定了抗PD1治疗后与T细胞扩增呈正相关或负相关的各种免疫表型和相关基因集，阐明了乳腺癌中抗PD1治疗反应的异质性。

图片          

实验设计：

对接受抗PD1治疗的初治疗患者(n = 29)或在抗PD1治疗前接受新辅助化疗的患者(n = 11)的配对治疗前和治疗中活检进行单细胞转录组、T细胞受体和蛋白质组分析。

主要研究结果：

一．抗PD1治疗前和治疗中的单细胞分析，发现表达PD1的T细胞在抗PD1治疗后增殖：研究者对29名初诊病人和11名经过新辅助化疗的病人进行肿块细针活检后给予10天左右抗PD-1抗体治疗，然后再手术切除肿块，并对免疫治疗前后的活检和术后肿块组织进行10x Genomics单细胞转录组联合免疫组库测序（scRNA-seq + scTCR-seq）以及单细胞转录组联合蛋白组测序（CITE-seq），并分析了免疫治疗前后肿瘤微环境内细胞组分的变化，从而鉴定出对免疫治疗结局有潜在贡献的特定细胞类型：恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。   

研究者分析了T细胞（扩增E vs 未扩增NE）和治疗(治疗前vs治疗期间)分层的scRNA-seq数据，发现治疗后NEs中成纤维细胞较多，Es中T细胞较多，在治疗期间，癌细胞和成纤维细胞在NEs中更常见，而T细胞在Es中进一步富集；对T细胞进行亚聚类，发现一个CD8 +及CD4 +细胞簇表达PD1，表示免疫检查点标志物（LAG3, HAVCR2, PDCD1）、效应(IFNG, NKG7)标志物和细胞毒性标志物 (GZMB, PRF1) 都表达的具有耗竭样的活化T细胞，并将该细胞称为经验T细胞（TEX细胞）。

二．T细胞沿着CD8+ TEX、CD4+ TH1和TFH细胞轨迹扩增：研究者通过拟时序分析，观察到CD8+ TEX细胞有三种不同的细胞分化轨迹，并且抗PD-1诱导的T细胞在持续扩增。辅助性CD4+ T 细胞（TH1、TFH）的细胞轨迹表明该细胞在很大程度上促进了克隆性的扩增，这也表明它们支持并辅佐CD8+ TEX细胞的持续效应功能。

三．T细胞中的表达信号可预测新辅助化疗和抗PD1治疗疗效：研究者两类主要靶点细胞所对应谱系的分化程度和克隆增殖情况可用来预测PD-1治疗后发生的反应，且PD-1治疗可能会进一步促进此类细胞的分化。          

四．与T细胞扩增相关的树突状细胞分析：树突状细胞(DCs)在调节CD8+ T细胞免疫和肿瘤抗原耐受之间的平衡中起着核心作用，研究者对树突状细胞(DCs)进行细胞亚型注释，得到6个抗-PD1表型，免疫组化结果分析得出，CXCL9和CXCL10是T细胞向肿瘤迁移的重要因素，且与免疫应答和抗原呈递相关的基因在治疗时均表达升高。由于巨噬细胞也可作为肿瘤免疫的中介，研究者将7952个髓系细胞分为10个表型，发现与树突状细胞相似，巨噬细胞也表达PD-L1和PD-L2，在亚簇水平上大多数巨噬细胞表型表达PD-L1。通过CITE-seq的分析可知，CCR2+或 MMP9+ 等巨噬细胞和多种树突状细胞亚型均与治疗反应呈正相关，而CX3CR1+巨噬细胞的比例与T细胞的克隆增殖呈负相关。该研究还发现乳腺癌中表达PD-L1的主要细胞类型并不是肿瘤细胞而是巨噬细胞和树突状细胞，而后两者PD-L1的高表达可以预测免疫治疗反应。

五．在抗PD1过程中，癌细胞受T细胞扩张影响：由于T细胞的活性依赖于癌细胞的肿瘤抗原呈递，于是研究者也分析了癌细胞的区室。与预处理相比，Es患者的癌细胞数量减少，增殖标志物MKI67的表达也被降低，并观察到NEs中有许多抗原呈递主要组织相容性复合体（MHC）I/II类基因下调。通过Es治疗前和治疗后的比较，证实了持续的抗肿瘤免疫反应，在Es治疗后的癌细胞中富集了细胞增殖、蛋白质水解、细胞死亡、免疫信号通路和细胞毒性途径。最后研究者分析了哪些细胞类型和表型的预处理与T细胞的扩增相关，发现CD4+或CD8+ TEX细胞、增殖T细胞、migDCs、巨噬细胞，表达PD-L1的表型（包括CCR2+和MMP9+巨噬菌体），与T细胞扩增呈正相关，而幼稚T细胞或效应/记忆T细胞与抑制性（CX3CR1+）巨噬菌细胞呈负相关。

总结：该研究抓住了免疫治疗前后10天左右这一短暂的时间窗口，针对乳腺癌与免疫检查点治疗之间的关联进行了深入研究，利用单细胞分析技术，对T细胞在免疫检查点抑制剂治疗中的克隆扩张和基因表达变化进行分析，发现了乳腺癌患者中特定T细胞亚型的扩张与治疗反应之间的关联，并且对免疫细胞间的相互作用、通路活性以及基因表达进行了全面的分析，为乳腺癌的免疫治疗提供了新的认识和研究方向。