肿瘤微环境中非肿瘤细胞上PD-L1的表达、调控与功能

小五

来源:觅健 2024-09-30 11:47:05

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关键词：小细胞肺癌布加替尼免疫治疗化疗顺铂

[Drug Discovery Today]肿瘤微环境中非肿瘤细胞上PD-L1的表达、调控与功能

原创 YYX 编译药物靶向与传递

2024年09月29日 11:58 四川听全文

程序性死亡蛋白1（PD-1）/抗程序性死亡配体1（PD-L1）疗法是癌症治疗中的重要手段，在多种恶性肿瘤中展现了良好的疗效，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌（RCC）和乳腺癌。PD-1是一种主要表达于活化的T细胞和B细胞上的免疫检查点受体，当与其配体PD-L1或PD-L2结合时，会抑制T细胞的功能，如增殖和细胞毒性，从而调节免疫反应。肿瘤细胞可以通过表达PD-L1并与浸润的T细胞上的PD-1结合来逃避免疫监视，进而导致T细胞耗竭。因此，阻断这一信号通路的抗PD-1或抗PD-L1抗体能够恢复T细胞活性，增强其杀伤肿瘤细胞的能力。

多种抗PD-1/PD-L1抗体药物正在进行临床试验或已被批准使用（图1a）。例如，针对PD-L1的单克隆抗体药物，如阿特珠单抗、阿维鲁单抗和度伐利尤单抗，已广泛应用于多种类型的肿瘤中。然而，这些抗PD-L1抗体药物仍面临诸多挑战，包括耐药性和相对较低的应答率。近期的临床试验显示，许多Ⅲ期试验正在积极推进，研究重点包括拓宽PD-L1抑制剂的应用范围以及探索有效的联合治疗方案。

舒格利单抗联合培门冬酶、吉西他滨和奥沙利铂（P-GemOx）治疗结外NK/T细胞淋巴瘤的研究（NCT05700448）；KL-A167联合顺铂和吉西他滨用于治疗复发或转移性鼻咽癌的疗效研究（NCT05294172）；放疗、卡培他滨联合奥沙利铂（CapeOx）及恩法利单抗用于微卫星稳定型（MSS）局部晚期直肠腺癌的研究方案（NCT05752136）。

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图1. PD-L1抑制剂的开发进展及临床阶段概览

近期研究表明，PD-L1不仅在肿瘤细胞上高度表达，还广泛存在于各种免疫细胞上，或以外泌体或可溶性PD-L1（sPD-L1）的形式存在于肿瘤微环境（TME）和外周免疫系统中（图2）。此外，非小细胞肺癌（NSCLC）、尿路上皮癌和食管鳞状细胞癌（SCC）在内的某些癌症显示出免疫细胞上PD-L1的表达高于肿瘤细胞。

Sprooten等发现，一种高免疫原性的Ⅰ型干扰素（IFN）高表达树突状细胞（DC）疫苗并未促进效应T细胞的活化，反而在肿瘤和淋巴结中诱导了PD-L1⁺巨噬细胞的上调，导致治疗效果不佳。这些不同形式和来源的PD-L1可能对肿瘤免疫逃逸以及抗PD-1/PD-L1抗体药物的疗效产生不同的影响。因此，系统了解PD-L1在肿瘤微环境中的存在和作用对于研发PD-1/PD-L1抑制剂至关重要。

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图2. PD-L1在肿瘤微环境中广泛表达

目前，针对PD-L1的小分子药物研究已成为肿瘤免疫检查点药物开发领域的重要方向（图1b）。Incyte公司正在推进两项临床研究：INCB-086550和INCB-099280。前期研究显示，INCB-086550的临床前活性与阿特珠单抗相当。吉利德公司也发布了GS-4224的Ⅰ期临床数据。临床前研究表明，GS-4224是一种强效、选择性好且具有口服生物利用度的PD-L1抑制剂。Ⅰ期临床试验（NCT04049617）的结果显示，GS-4224在晚期实体瘤患者具的安全性良好，并且在每日剂量400 mg至1500 mg时具有良好的耐受性。多数小分子抑制剂仍处于Ⅰ期试验中，主要评估其安全性和药代动力学特性，而其临床疗效还需要进一步的临床药效学评估。

一些PD-1/PD-L1抑制剂的治疗效果不尽如人意，因为它们无法下调免疫细胞上的PD-L1表达。因此，深入理解PD-L1在体内的表达和功能对于合理设计能够减少潜在副作用的药物至关重要。开发能够精确识别肿瘤细胞上高表达PD-L1的双特异性抗体，同时避免其对免疫细胞的影响，可能成为减少免疫相关毒性的重要策略。

目前尚无系统综述文章总结PD-L1在各种免疫细胞上的功能与表达。本文的目的是全面深入地了解PD-L1在肿瘤微环境（TME）中各种免疫细胞上的表达和功能机制，及其不同形式的特征。作者重点总结了近年来关于PD-L1在免疫细胞和肿瘤细胞上表达和功能的最新研究进展，有助于加深对PD-L1生理作用及其相关抑制剂体内机制的理解，也为药物开发者提供合理的药物设计策略，并帮助他们预见与药物开发相关的潜在风险。

1. PD-L1在肿瘤细胞上的表达与功能

肿瘤细胞可以表达PD-L1并与T细胞上的PD-1结合，从而抑制T细胞的活化和增殖，削弱T细胞介导的免疫反应。PD-L1在肿瘤细胞上的表达受到多种机制的调控，包括转录调控、转录后调控和翻译后修饰（图3a）。在转录调控方面，表观遗传修饰（如CD274启动子区域的组蛋白乙酰化和甲基化）以及基因组变异都对PD-L1的表达有影响。一些炎症信号分子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-12和IL-17，已被证实能够调节PD-L1的表达。此外，一些致癌信号通路也参与了PD-L1的上调，包括表皮生长因子受体（EGFR）通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、核因子κB（NF‑κB）通路以及Janus激酶（JAK）-信号转导与转录激活因子（STAT）通路。缺氧环境也可以通过缺氧诱导因子（HIFs）增加PD-L1的mRNA和蛋白表达。

在转录后调控中，肿瘤来源的miRNA和CD274 mRNA的稳定性是调控肿瘤微环境（TME）中PD-L1表达的重要因素。此外，翻译后修饰，包括泛素化、磷酸化、糖基化、棕榈酰化和小泛素样修饰（SUMOylation），对于调节PD-L1蛋白的稳定性至关重要。

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图3. 肿瘤细胞及多种免疫细胞上PD-L1的表达与调控

2. PD-L1在T细胞上的表达与功能

除肿瘤细胞外，T细胞也表达PD-L1，并具有独特的功能。肿瘤浸润性T细胞（TILs）是肿瘤组织中PD-L1的主要来源之一，且TILs上PD-L1的表达与抗PD-1疗法的疗效密切相关。TILs上的PD-L1表达受到肿瘤抗原和炎症细胞因子的动态调控（图3b）。当肿瘤细胞发生凋亡时，它们释放肿瘤抗原和炎症细胞因子，从而诱导肿瘤浸润性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）上PD-L1的表达。

Diskin等报告，在胰腺导管腺癌（PDA）中，T细胞上的PD-L1与多种细胞表面活化标记物、共刺激分子和免疫检查点受体高度共表达。这些分子包括CD44、CD69、CD39，以及ICOS、LFA-1、TIM-3、PD-1等。此外，PD-L1还与细胞因子、转录因子、穿孔素和颗粒酶（如IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-23R、FOXO1和颗粒酶B）高度共表达。这表明，在PDA中，T细胞上的PD-L1表达可能与这些分子、细胞因子和转录因子密切相关。通过阻断IL-4、IFN-γ和IL-27，可以降低T细胞上PD-L1的表达。研究还发现，肿瘤抗原特异性T细胞通过JAK-STAT信号通路表现出比非特异性T细胞更高的PD-L1表达。这些细胞因子和信号通路在PD-L1调控中起着关键作用。T细胞上的PD-L1具有双向信号传导功能，既可以通过PD-L1向PD-1传递信号，也可以通过PD-1向PD-L1传递信号，从而调节免疫反应。当T细胞上的PD-L1与PD-1结合时，这两个分子都会被激活，同时PD-L1⁺ T细胞和PD-1⁺ T细胞或其他免疫细胞的功能状态也会发生变化。在经典的信号传导路径中，PD-L1的正向信号传导（PD-L1→PD-1）指的是PD-L1作为配体与其他T细胞或免疫细胞上的PD-1结合，进而影响相关PD-1⁺细胞的功能和状态。PD-L1⁺ T细胞通过PD-1/PD-L1相互作用影响一系列PD-1⁺免疫细胞的功能和分化。例如，PD-L1⁺ T细胞可以抑制效应T细胞的抗肿瘤活性，或将M1型巨噬细胞转化为M2型（图4d）。Diskin的研究还发现，在胰腺导管腺癌（PDA）的肿瘤微环境中，PD-L1⁺ T细胞和PD-1⁺ T细胞在空间上比PD-L1⁺抗原呈递细胞（APCs）更接近。这表明，与APCs相比，T细胞通过PD-1/PD-L1轴抑制效应T细胞的能力更强。

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图4. PD-L1的表达影响肿瘤微环境中多种细胞的

激活、分化和存活

相比之下，PD-L1的反向信号传导（PD-1→PD-L1）指的是PD-L1与PD-1结合后，从PD-1向PD-L1⁺ T细胞传递信号。这种反向信号传导会影响T细胞的分化和功能。具体而言，它通过抑制T细胞中的STAT1信号通路，阻止CD4⁺ T细胞分化为具有抗肿瘤免疫功能的辅助性T细胞（Th1细胞）；同时，激活STAT3信号通路，促进CD4⁺ T细胞分化为有助于肿瘤生长的Th17细胞。此外，细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）的表达减少，这进一步减弱了对STAT3的抑制作用，增强了与STAT3相关的信号通路（图4d）。

除通过与PD-1的相互作用发挥双向信号传导功能，PD-L1还具有促进T细胞存活的功能（图4c）。CD8⁺ T细胞激活后，PD-L1在维持T细胞存活中起到了关键作用。在免疫反应的收缩阶段，活化的T细胞通过高水平表达PD-L1，维持抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达，进而激活JAK/STAT3信号通路。

3. PD-L1在巨噬细胞上的表达与功能

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）中数量最为丰富的免疫细胞之一，在肿瘤免疫中发挥着关键的调控作用。TAMs是TME中PD-L1的主要来源之一，其表达受多种机制和因素的调控，包括信号通路、细胞因子以及肠道微生物代谢物等（图3d）。

Fang等人的研究发现，前颗粒蛋白（PGRN）能够通过激活STAT3信号通路，促进TAMs向M2型极化并上调PD-L1的表达。Xu等人表明，乳腺癌细胞通过含有PD-L1⁺ CD163⁺巨噬细胞的外泌体小RNA（sEV-miR-106b-5p和sEV-miR-18a-5p）传递给巨噬细胞，随后通过PTEN/AKT和PIAS3/STAT3信号通路，诱导了PD-L1的表达和巨噬细胞的极化。一些研究还发现，TAMs上的PD-L1可以通过IFN-γ依赖但并不直接依赖IFN-γ的方式被诱导。

此外，Zhang等人发现，IL-6可以通过降低蛋白酪氨酸磷酸酶受体型O（PTPRO）的表达，促进PD-L1的上调。在肝细胞癌（HCC）患者的血清中，IL-6水平显著升高，并通过激活STAT3/c-MYC信号通路，进一步增加了miR-25-3p的转录。随后，miR-25-3p通过靶向PTPRO的3′非编码区（UTR），抑制了PTPRO的转录和蛋白表达，导致PTPRO水平下降。PTPRO的减少解除对PD-L1的抑制，进而推动PD-L1的表达。此外，PTPRO还能通过抑制JAK2/STAT1和JAK2/STAT3/c-MYC信号通路，在TME中进一步抑制TAMs上PD-L1的表达。

此外，肠道微生物及其代谢产物也是影响PD-L1表达的重要调节因素。最近的研究发现，胃癌患者体内的肠道微生物来源的丁酸水平低于健康人群。值得注意的是，丁酸通过抑制STAT3和NF-κB信号通路，减少了胃癌患者巨噬细胞上PD-L1的表达。

4．PD-L1在树突状细胞上的表达与功能

树突状细胞（DCs）是肿瘤微环境（TME）中最重要的抗原呈递细胞（APCs）。最近的研究表明，DCs上的PD-L1是TME中PD-L1的关键来源之一。无论是外周DCs还是肿瘤相关DCs，在静息状态下都具有高水平的PD-L1表达。

PD-L1在DCs上的表达受TME中不同细胞和细胞因子的动态调控。（见图3d）例如，CD8⁺ T细胞和活化T细胞产生的IFN-γ可以促进PD-L1在DCs上的表达。在卵巢癌的TME中，白细胞介素-10（IL-10）和血管内皮生长因子（VEGF）同样能够诱导髓源性树突状细胞（MDCs）上PD-L1的表达。尽管DCs是将肿瘤抗原呈递给T细胞的主要APCs，PD-L1的上调可以保护DCs免于细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的攻击，同时抑制抗肿瘤免疫反应。

阻断PD-L1可以进一步增强MDCs对T细胞的激活作用，减少T细胞中的IL-10，诱导IL-2和IFN-γ的分泌，从而提升T细胞的抗肿瘤免疫能力。用抗PD-L1抗体处理的DCs能显著促进CD8⁺ T细胞的增殖和颗粒酶B的产生，进而增强T细胞的效应功能，这表现为T细胞中T-bet和Eomesodermin（Eomes）水平的升高。T-bet和Eomes共同调控T细胞中靶基因的转录。

除了细胞因子外，miRNA和缺氧环境也是调节PD-L1在DCs、巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）上表达的关键因素。Zhang等人的研究表明，在乳腺癌小鼠的DCs中，miR-5119通过结合PD-L1的3′非编码区（UTR）直接下调其表达。Noman等人发现，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）通过与PD-L1近端启动子中的缺氧反应元件（HRE）结合，上调了PD-L1的表达。因此，结合阻断PD-L1和抑制HIF-1α的策略可能成为癌症免疫治疗的新方案。

PD-L1不仅可以与PD-1结合，还能与CD80相互作用，从而发挥免疫调节作用（图4b）。研究表明，包括树突状细胞（DCs）在内的抗原呈递细胞（APCs）会同时表达PD-L1和CD80，这两种分子能够在同一个细胞膜上发生“顺式”相互作用。这种相互作用会同时抑制PD-L1与PD-1以及CD80与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的结合，但不会影响CD80与CD28的结合。具体来说，当CD80的表达高于PD-L1时，过量的CD80会与CTLA-4结合，促进CTLA-4介导的反向内吞作用；而当PD-L1的表达超过CD80时，PD-L1会阻止CD80被CTLA-4介导的反向内吞，从而削弱CTLA-4及其调节性T细胞（Tregs）的功能。进一步的研究发现，肿瘤相关DCs上PD-L1的表达量通常高于CD80。

抗PD-L1抗体不仅可以阻断PD-L1与PD-1的相互作用，还能够阻断PD-L1与CD80之间的顺式相互作用。一方面，这些抗体可以增强CD80与CD28的结合，促进T细胞的免疫反应；但另一方面，这也会促进CD80与CTLA-4的结合，从而激活CTLA-4通路，抑制T细胞的活性。因此，同时阻断PD-L1和CTLA-4可以有效避免抗PD-L1抗体产生的这一“副作用”。此外，PD-L1对DCs的影响不仅限于调节T细胞的活化，还涉及到DC的成熟和抗原呈递功能。研究表明，阻断PD-L1可以增强DC的成熟以及其抗原呈递的能力。

5．PD-L1在B细胞上的表达与功能

B细胞在发育、成熟以及最终分化为抗体分泌的浆细胞或记忆B细胞的过程中，始终需要抗原的刺激。在肿瘤微环境（TME）中，B细胞可以通过抗原呈递、抗体产生或细胞因子释放，直接或间接地影响肿瘤细胞。

最新研究表明，B细胞表面PD-L1的表达在调节免疫系统中发挥着重要作用，尤其是在抑制T细胞反应、促进肿瘤进展以及影响T细胞分化方面。特别是一类高表达PD-L1的调节性B细胞（Bregs）在多种癌症研究中引起了广泛关注。Bregs上的PD-L1通过与PD-1结合，有效阻断了T细胞激活所需的信号通路，展现出其在免疫调控中的重要作用。

Shen等人在乳腺癌研究中发现，髓源性抑制细胞（MDSCs）能够诱导一群PD-1阴性、PD-L1阳性、CD19阳性的Bregs，这些Bregs能够直接抑制T细胞免疫反应。Olkhanud等人还发现，肿瘤诱导的Bregs不仅高表达PD-L1、CD81和CD86，还能促进调节性T细胞（Tregs）的生成，从而加速乳腺癌的进展和转移。同样，PD-L1阳性B细胞通过PD-L1介导的通路以及分泌免疫抑制性细胞因子（如IL-10和TGF-β），抑制了CTLs的活性，这一机制在黑色素瘤、结直肠癌和前列腺癌中也被观察到。

此外，PD-L1阳性B细胞在调节T细胞亚群的分化和增殖中起到了重要作用，尤其是在体液免疫至关重要的滤泡辅助性T细胞（T_FH细胞）的发育中。PD-L1高表达的B细胞通过PD-1/PD-L1通路与活化的CD4⁺ T细胞相互作用，进而增加了T细胞中STAT5的表达，抑制了关键转录因子Bcl-6的活性，阻碍了CD4⁺ T细胞向T_FH细胞的正常分化。这进一步突显了PD-L1阳性B细胞在免疫反应网络中的复杂调节作用。

未来的研究应继续深入探讨B细胞在实体瘤免疫抑制中的作用。其中，重点可以放在B细胞表面PD-L1表达作为潜在生物标志物的意义，以及其对自身免疫疾病治疗结果的影响。值得注意的是，Cubas等人的研究发现，HIV感染者的淋巴结生发中心中PD-L1阳性B细胞的数量有所增加。这一发现表明，PD-L1阳性B细胞可能成为HIV感染的预测性生物标志物。

6．PD-L1在自然杀伤细胞上的表达与功能

自然杀伤细胞（NK细胞）是除了T细胞和B细胞之外数量最多的淋巴细胞之一，是人体最重要的免疫细胞之一。它们在免疫防御中发挥着关键作用，能够识别并消除被病原体感染的细胞和癌细胞。

Dong等人发现，人类外周血中的NK细胞PD-L1表达水平较低。然而，他们进一步发现，当NK细胞与K562细胞（低PD-L1表达的髓系白血病细胞）共培养时，NK细胞被强烈激活，并上调了如T-box转录因子21（TBX21）、EOMES和CD226等激活或成熟的标志物。同时，肿瘤细胞通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路诱导NK细胞表达PD-L1，这可能是NK细胞为防止过度激活而产生的一种自我保护机制。

当使用PD-L1抗体阿替利珠单抗（Tecentriq）阻断NK细胞上的PD-L1时，p38/NF-κB信号通路重新被激活，进而增强了CD107a和IFN-γ的表达，提升了NK细胞的免疫监视和杀伤能力，同时也进一步诱导了NK细胞上的PD-L1表达。这种机制使更多的PD-L1与抗体结合，持续通过p38信号通路激活NK细胞。从临床角度看，NK细胞上PD-L1的变化情况可能成为急性髓系白血病（AML）患者治疗反应和预后的重要参考指标。

7．PD-L1在肥大细胞上的表达与功能

肥大细胞（MCs）是一种来源于骨髓多能造血干细胞的先天免疫细胞，通过释放多种可溶性介质参与免疫调节。这些介质包括组胺、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMPs）、趋化因子配体1（CXCL1）和CXCL8，它们在肿瘤细胞增殖、血管生成和肿瘤生长中发挥重要作用。然而，肥大细胞的调节作用并非一成不变，有时促进肿瘤血管生成，有时抑制肿瘤的形成和扩展。这取决于介质的类型和浓度，以及肥大细胞所在的位置与其在肿瘤微环境（TME）中与其他成分的相互作用。Nakae等人发现，来源于骨髓的肥大细胞可以表达PD-L1。此外，成人肥大细胞增多症患者血清中的PD-L1浓度与疾病的严重程度相关。

肥大细胞不仅通过释放各种可溶性介质参与免疫调节，还通过PD-1/PD-L1通路影响肿瘤的生长。在胃癌中，在CXCL12/CXCR4等趋化因子的作用下，肥大细胞大量聚集，并通过PD-L1浓度依赖机制抑制T细胞的增殖和功能，从而促进肿瘤的形成和扩展。同时，肿瘤来源的TNF-α通过NF-κB信号通路诱导肥大细胞上PD-L1的表达，进一步抑制T细胞的功能。

Hirano等人发现，在小鼠接触性超敏反应（CHS）的诱导阶段，肥大细胞上的PD-L1可以抑制CD8⁺ T细胞的激活。与此同时，在皮肤中的抗辐射细胞中，肥大细胞的PD-L1表达水平是最高的。在缺失肥大细胞的小鼠模型（WBB6F1/J-Kit^W/Kit^W-v/J和C57BL/6-Kit^W-sh/W-sh）中，注射抗PD-L1阻断抗体后，并未观察到显著的炎症反应，例如CD8⁺ T细胞导致的耳部肿胀加剧和IFN-γ的增加，这表明肥大细胞可能在PD-L1介导的免疫调节中发挥了关键作用。此外，在小鼠皮肤过敏反应中，阻断PD-L1可以抑制肥大细胞的活化和脱颗粒功能。肥大细胞上的PD-L1不仅在肿瘤免疫逃逸中发挥调节作用，还在皮肤免疫和炎症反应中扮演重要角色。

8．肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中PD-L1的表达与功能

PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法主要被认为是在肿瘤微环境（TME）中发挥作用，通过重新激活T细胞来恢复机体的抗肿瘤免疫反应。最近的研究表明，在治疗基底细胞癌（BCC）和鳞状细胞癌（SCC）时，PD-(L)1阻断疗法可以促进新T细胞受体（TCR）克隆的扩增。有趣的是，这些增殖并非来自肿瘤内部原有的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），而是源自此前未在肿瘤部位检测到的新克隆，表明这些T细胞克隆可能起源于肿瘤外部。肿瘤引流淋巴结（TDLNs）在抗原呈递以及肿瘤特异性免疫的建立中发挥了关键作用，因此它们被视为体内重要的肿瘤特异性T细胞储备。此外，TDLNs富含B7分子（如CD80和CD86），这些分子通过与T细胞上的共刺激受体CD28结合，显著促进了T细胞的激活和增殖。同时，肿瘤引流淋巴结中存在大量表达PD-1的肿瘤特异性T细胞以及PD-L1高表达的髓系细胞，PD-1/PD-L1的相互作用抑制了T细胞的活化。这些新发现为进一步研究PD-L1阻断疗法中TDLNs的作用及其潜在机制提供了重要启示。

最近的研究表明，在TDLNs中，表达PD-L1的细胞包括迁移性cDC2、位于被膜下区的巨噬细胞[CD169⁺被膜下窦巨噬细胞（SSMs）]、髓质窦中的巨噬细胞[F4/80⁺髓质窦巨噬细胞（MSMs）]以及淋巴管内皮细胞（LECs）。通过共聚焦显微镜的观察发现，TDLNs中的CD8⁺ T细胞并没有与SSMs和MSMs重叠分布，而是主要与cDC2相互作用。这表明，针对PD-L1表达的cDC2s可能成为增强通过TDLNs调节抗肿瘤免疫策略的潜在靶点。Cousin等人的研究进一步证实，淋巴结中的LECs通过上调PD-L1的表达，诱导肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在TDLNs中凋亡，从而抑制了对肿瘤的免疫反应。此外，Dammeijer的研究显示，在TDLNs中阻断PD-L1能够显著增强T细胞的激活和启动。Zhou及其团队开发了一种靶向TDLNs的疫苗，并结合PD-1抗体，成功激活并扩增了肿瘤抗原特异性效应T细胞，逆转了TDLNs中的免疫抑制。因此，PD-1/PD-L1轴在TDLNs中的活动，可能比在肿瘤本身的作用更为关键，成为PD-1/PD-L1检查点阻断抗体的主要靶点。

9．非膜PD-L1的表达与功能

PD-L1蛋白在细胞内外具有广泛的分布和多种形式（见图5）。除了膜PD-L1（mPD-L1）外，它还可以以核PD-L1（nPD-L1）、胞质PD-L1（cPD-L1）、细胞外囊泡PD-L1（EV PD-L1）和可溶性PD-L1（sPD-L1）形式存在。不同形式的PD-L1揭示了其复杂性，并为我们提供了新的视角，以更好地理解癌症的免疫逃逸机制。

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图5. 肿瘤微环境中PD-L1的多种形式

核PD-L1（nPD-L1）的表达与功能

PD-L1的核定位已在多种癌症中得到证实，包括食管癌、结直肠癌、前列腺癌和乳腺癌。近年的研究深入探讨了PD-L1核易位的动态过程、其内在作用以及复杂的调控机制。Du等人率先发现，PD-L1通过与核转运蛋白karyopherin β1（KPNB1）结合，被运输到癌细胞的细胞核中。Ghebeh等人在乳腺癌细胞中检测到了nPD-L1，并发现阿霉素可以通过激活AKT磷酸化通路，进而增加nPD-L1的表达。

最新研究强调了nPD-L1表达与癌症预后之间的密切联系。例如，循环肿瘤细胞（CTCs）中nPD-L1的存在与结直肠癌患者预后较差相关。在食管癌中，nPD-L1的表达水平与肿瘤侵袭深度显著相关。同样，脉络膜黑色素瘤（UM）细胞中nPD-L1比例的增加通过增强早期生长反应基因1（EGR1）的转录活性，促进了血管生成，而EGR1是影响不良结局的关键因素。

在免疫基因调控方面，Gao等人表明，PD-L1向细胞核的转运受p300介导的乙酰化和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）依赖的去乙酰化调控。在三阴性乳腺癌（TNBC）和低Sororin表达的癌症中，nPD-L1通过拮抗Wings apart-like（WAPL）并与PDS5凝集素相关因子B（PDS5B）竞争结合，从而调节姐妹染色单体的黏连。

在肿瘤细胞增殖方面，nPD-L1与转录因子Sp1结合，调控生长抑制特异性基因6（Gas6）mRNA的产生和释放，进而激活Mer酪氨酸激酶（MerTK）信号通路，促进非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的生长。此外，PD-L1还与磷酸化的STAT3相互作用，帮助其进入细胞核，促进gasdermin C（GSDMC）的转录，将TNF-α诱导的细胞凋亡过程转变为焦亡，最终导致肿瘤坏死。综上所述，这些研究揭示了nPD-L1在肿瘤进展和免疫逃逸中的复杂多样作用，以及其在癌症患者预后中的重要意义。

胞质PD-L1（cPD-L1）的表达与功能

目前的研究逐渐揭示了cPD-L1在免疫调节之外的多重作用。这些功能不仅对肿瘤细胞的增殖至关重要，还能增强其对放射治疗和DNA损伤的抵抗力，从而加速肿瘤的恶化。例如，在卵巢癌细胞中，cPD-L1的表达被证实能够促进细胞的增殖，并与细胞生长的加速密切相关。L-甲状腺素（T4）通过激活STAT3通路提高了cPD-L1的水平，阻止了白藜芦醇诱导的环氧合酶-2（COX-2）进入细胞核，从而削弱了白藜芦醇的抗增殖效果。

此外，cPD-L1通过多种机制帮助肿瘤抵御放射和DNA损伤。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）模型中，cPD-L1与放射抗性细胞中的Akt-1相互作用，而胞质中的Akt-1对于放射抗性至关重要。cPD-L1还通过激活环鸟苷酸-腺苷酸合酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路，有效抑制了IFN-β的表达，进而激活了一组促进生存的干扰素调控基因（IRGs），增加了细胞对DNA损伤的耐受性。

Tu等人的研究表明，cPD-L1能够稳定与DNA损伤反应相关蛋白的mRNA，从而促进DNA修复，防止癌细胞因DNA损伤而死亡。免疫荧光共聚焦成像显示，在胰腺腺癌（PA）细胞的胞质中，PD-L1、COX-2和精氨酸酶1（ARG1）共同表达，表明存在COX-2/PD-L1/ARG1信号通路。该通路显示，COX-2上调PD-L1的同时也增强了ARG1的表达，从而共同促进胰腺癌的发展。总的来说，cPD-L1在肿瘤细胞的增殖、DNA损伤修复和肿瘤进展中发挥了关键作用，其功能远远超出了单纯的免疫逃逸，涉及复杂的分子调控网络。

外泌体PD-L1（exoPD-L1）的表达与功能

细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌到细胞外环境中的小囊泡，主要分为两类：外泌体和微囊泡。外泌体来源于内体，在多泡体（MVBs）与细胞膜融合后被释放到细胞外，直径约为30–150 nm；微囊泡则是由细胞膜直接出芽产生，直径为50–1000 nm。

许多研究表明，肿瘤来源的exoPD-L1在免疫抑制和肿瘤进展中起着重要作用。exoPD-L1可以将PD-L1传递至肿瘤微环境（TME）中的其他类型细胞，如肿瘤细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs），从而扩大PD-L1在TME中的分布范围。为了评估exoPD-L1在TME中的作用，Yang等人通过差速离心法从乳腺癌细胞培养基的上清液中分离出外泌体，并检测到其中含有exoPD-L1蛋白。实验结果表明，exoPD-L1能够以剂量依赖的方式抑制由CD3/CD28诱导的T细胞ERK磷酸化和NF-κB活化。此外，exoPD-L1还可以抑制T细胞分泌颗粒酶B，从而降低细胞毒性T细胞的活性。

除了在TME中的作用，Chen等人还发现，转移性黑色素瘤细胞释放的exoPD-L1能够进入外周循环系统，直接与T细胞接触，抑制其功能，并在全身范围内产生免疫抑制作用。研究还表明，IFN-γ能够上调exoPD-L1的表达，抑制CD8⁺ T细胞的功能，促进肿瘤生长。Ricklefs等人的研究显示，部分胶质母细胞瘤来源的EVs表面也表达PD-L1，并且可以与T细胞上的PD-1结合，有效抑制T细胞的活化。

Poggio等人构建了一个对免疫检查点抑制剂耐药的鼠胰腺癌模型，并通过敲除两个与外泌体相关的基因，使肿瘤细胞无法分泌外泌体。在阻断PD-L1后，这些无法分泌外泌体的肿瘤细胞被免疫系统识别并消灭，这表明外泌体在肿瘤免疫逃逸中发挥了关键作用。此外，在另一种鼠结直肠癌模型中，阻断外泌体和使用PD-L1抑制剂的联合治疗显著延长了小鼠的生存期。ExoPD-L1为肿瘤细胞提供了一种通过淋巴系统和血液的传播途径，从而影响TME之外更广泛区域的免疫细胞激活。这一机制可能对免疫抑制和耐药性产生深远影响。

肿瘤患者外周血中exoPD-L1的表达水平不仅可以作为胃癌和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者预后不良的生物标志物，还能够有效评估PD-1单克隆抗体治疗的疗效。研究人员进一步探讨了exoPD-L1与不同癌症类型中肿瘤细胞上PD-L1表达水平的相关性。Kim等人在多种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系（A549、H1975、H460）中检测到了exoPD-L1，发现其含量与细胞内PD-L1的表达水平呈正相关。同样，Fan等人从人胃癌细胞系（MGC803、MKN74）中分离出的外泌体中也观察到exoPD-L1与细胞内PD-L1表达的正相关性。

此外，Cordonnier等人在100名黑色素瘤患者的血浆外泌体中检测到了PD-L1，发现循环中外泌体的PD-L1水平有助于癌症的早期诊断。在黑色素瘤和肺癌患者的血浆样本中，外泌体PD-L1的水平显著高于健康人群，说明循环中的PD-L1更容易被检测到。在一项前瞻性临床试验中，研究人员比较了100名黑色素瘤患者血浆中的exoPD-L1水平与肿瘤组织活检中PD-L1的表达情况。结果显示，exoPD-L1在所有血浆样本中均被检测到，而PD-L1仅在67% 的肿瘤组织活检样本中检测到。此外，exoPD-L1的水平还可以预测黑色素瘤患者对治疗的反应。研究表明，exoPD-L1的水平与治疗反应呈负相关：当影像学显示肿瘤反应时，exoPD-L1的水平下降；而当影像学显示肿瘤进展时，exoPD-L1的水平上升。

然而，exoPD-L1作为生物标志物也存在一定的局限性和挑战。一方面，exoPD-L1的表达受干扰素-γ（IFN-γ）调控，循环外泌体中的PD-L1水平与IFN-γ水平及肿瘤大小呈正相关，并且在抗PD-1治疗的过程中会发生变化。另一方面，不同患者和不同类型的肿瘤中，exoPD-L1的表达水平存在差异。除了肿瘤细胞，其他细胞如免疫细胞和间充质干细胞（MSCs）也能产生表达PD-L1的外泌体。尽管存在这些差异，但由于exoPD-L1的采集相对容易，且能够动态监测，它在评估患者治疗反应方面依然具有重要作用。这些研究表明，exoPD-L1在肿瘤免疫逃逸和免疫检查点抑制剂治疗中具有重要的作用和价值。

可溶性PD-L1（sPD-L1）的表达与功能

PD-L1的表达水平可以作为一种生物标志物，用于评估患者是否适合接受PD-L1抑制剂治疗。然而，在晚期肾细胞癌（RCC）患者中，由于获取肿瘤样本的困难以及肿瘤异质性，评估肿瘤组织中的PD-L1表达十分困难。相比之下，在血液中检测sPD-L1要相对容易得多。在一项临床试验中，研究人员通过单分子阵列法检测了转移性透明细胞RCC患者血清中的sPD-L1浓度，证实sPD-L1在RCC治疗的早期和晚期阶段可以作为预测PD-1抑制剂纳武单抗（nivolumab）疗效的生物标志物。同样，Jia等人发现，sPD-L1浓度也能够预测EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者对EGFR靶向治疗的反应。

sPD-L1是一种细胞外、无细胞形式的PD-L1，可以通过编码单体或二聚体PD-L1的mRNA剪接变体产生，或者通过细胞表面的蛋白酶切割产生。肿瘤细胞和免疫细胞在转录和翻译过程中都可以产生sPD-L1。Chen等人发现，表达膜PD-L1（mPD-L1）的细胞系能够分泌大量sPD-L1，而抑制基质金属蛋白酶（MMP）则可以减少sPD-L1的分泌，这表明MMP在sPD-L1分泌的调控中起到关键作用。Zhou等人在所有黑色素瘤细胞系中发现了选择性剪接（AS）现象，产生了多种不同的剪接异构体，这些异构体缺乏跨膜结构，因而促使sPD-L1的分泌。诸如IFN-α、IFN-γ和TNF-α等细胞因子能够增强PD-L1的剪接活性，从而增加sPD-L1的分泌。

此外，Frigola等人报告称，活化的成熟树突状细胞（DCs）能够产生并释放sPD-L1。研究还表明，自然杀伤（NK）细胞也能释放PD-L1。Jia等人提出，sPD-L1可能在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）到达肿瘤之前，已经与外周血中的循环T细胞上的PD-1结合，从而削弱T细胞介导的抗肿瘤免疫活性。总体而言，mPD-L1和sPD-L1都具有免疫抑制作用。哪种形式的PD-L1占主导地位，以及不同形式的PD-L1之间是否存在相互作用，目前仍不清楚。

10. 抗PD-1/PD-L1免疫治疗的耐药机制及

联合治疗策略

尽管PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在某些类型的癌症中表现出显著疗效，但并非所有患者都能从中获益，部分患者甚至会产生原发性或获得性耐药。导致抗PD疗法耐药的因素多种多样。（见图6）陈教授团队的一篇综述文章为我们提供了宝贵的见解。这些因素大致可归纳为几个关键过程：肿瘤抗原的呈递、T细胞的激活与浸润，以及T细胞对肿瘤细胞的识别与杀伤。

首先，抗原的缺失和肿瘤抗原呈递的缺陷会导致免疫逃逸，这是抗PD疗法耐药的主要原因之一。另一个关键因素是T细胞功能障碍。PD-1/PD-L1的阻断可能会引发其他负性免疫检查点的补偿性上调，例如T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）和淋巴细胞活化基因3（LAG-3），从而抑制T细胞的激活。此外，癌症相关基因（如磷酸酶和张力蛋白同源物PTEN）的突变或缺失会通过激活PI3K/AKT信号通路上调PD-L1的表达，从而抑制T细胞的活性，这一过程还与T细胞浸润的减少密切相关。

与此同时，肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制性细胞因子（如白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-β（TGF-β））和免疫抑制性细胞（如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs））的增加，会进一步抑制T细胞的功能，维持免疫抑制的环境。肿瘤细胞上PD-L1的低表达或缺失也是耐药的直接原因之一。因此，促进有效的抗原呈递、降低免疫抑制因子的影响并提升免疫细胞的浸润对于抗PD疗法的成功至关重要。除此之外，代谢变化、表观遗传修饰以及微生物群的改变等多种因素也可能影响抗PD疗法的效果。

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图6. 抗PD-1/PD-L1免疫治疗的耐药机制

为了克服PD-1/PD-L1免疫治疗的耐药性，研究人员正在积极探索多种联合治疗方案。这些方案大致分为两类。一类疗法通常会导致PD-1/PD-L1蛋白的上调，而与PD-L1抑制剂联合使用可以抵消因PD-L1上调引发的免疫抑制作用。例如，化疗药物多西他赛（DTX）可以通过NF-κB通路诱导前列腺癌细胞中的PD-L1表达。在非小细胞肺癌（NSCLC）、三阴性乳腺癌（TNBC）和小细胞肺癌（SCLC）的治疗中，研究表明，PD-L1抑制剂与化疗药物如卡铂和顺铂联合使用，能够显著提高患者的应答率并延长其生存期。

第二类联合疗法主要针对肿瘤微环境（TME）中抗原呈递不足、免疫抑制因子增加或免疫细胞浸润不足的情况。诱导免疫原性细胞死亡（ICD）是一种提升肿瘤免疫原性、增强免疫疗效的有效方法。例如，蒽环类化疗药物和放疗可以通过引发ICD来提高肿瘤免疫原性，从而使那些原本对PD-1/PD-L1抑制剂无反应的患者产生积极的治疗效果。此外，针对免疫抑制性细胞因子或细胞（如髓源性抑制细胞MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞TAMs和调节性T细胞Tregs）的治疗策略可以改善T细胞功能，打破免疫抑制的肿瘤微环境。临床研究表明，VEGF作为MDSCs的趋化因子，抗VEGF重组人单克隆抗体贝伐单抗（Bevacizumab）能够减少乳腺癌患者肿瘤中的MDSC浸润，并降低外周血中的IL-6水平。

与此同时，增加肿瘤部位T细胞的浸润也是提高抗PD疗法效果的关键途径。在肝细胞癌中，选择性HDAC8抑制剂PCI-34051能够增加浸润的CD8⁺ T细胞数量，从而增强PD-L1抗体的疗效。此外，对于那些对PD疗法产生耐药的患者，CTLA-4、LAG-3和TIM-3等抑制性免疫检查点可能会补偿性上调，联合使用这些检查点抑制剂能够增强抗肿瘤反应并克服耐药问题。基于NCT03298451临床试验的结果，FDA批准了CTLA-4抑制剂tremelimumab与PD-L1抑制剂durvalumab联合治疗不可切除肝细胞癌（uHCC）成人患者，这突显了双重免疫检查点阻断疗法在治疗难治性肿瘤中的显著潜力。与单一药物疗法相比，tremelimumab与durvalumab的联合方案在非小细胞肺癌（NSCLC）、转移性结直肠癌、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌和子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中展现出更佳的疗效。

总结

PD-L1抑制剂的研究主要聚焦于肿瘤细胞表面的PD-L1，而忽视了其在肿瘤微环境中的复杂性。本文系统探讨了PD-L1在各种免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞）以及非免疫细胞中的表达和功能，揭示了PD-L1的多种形式（膜型、核型、胞质型、可溶性和外泌体）在肿瘤免疫调节中的独特作用。全面了解PD-L1的多样性和多功能性，有助于开发多靶点药物和新的治疗策略，克服免疫治疗的耐药性，提高临床疗效。

原文来源：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359644624003064

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