乳腺癌肿瘤异质性，并构建免疫治疗预测模型，以推动精准医学与早期检测

小五

来源:觅健 2026-02-02 08:57:26

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关键词：免疫治疗

机器学习 | 多组学分析揭示乳腺癌肿瘤异质性，并构建免疫治疗预测模型，以推动精准医学与早期检测

原创

李自涛医生

涛涛医道行

2026年1月29日 06:04

青海

当你以为乳腺癌只是ER、HER2、TNBC的简单分类时，肿瘤内部正在上演一场复杂的“细胞社会战争”。最新研究通过单细胞与空间转录组学，像高分辨率显微镜一样，透视了乳腺癌内部的异质性“丛林”——原来，即使在同一肿瘤里，也存在多个细胞亚群，它们各有各的生存策略。尤其是基底样乳腺癌细胞，仿佛一群“隐形刺客”，不仅擅长免疫逃逸，还与不良预后紧密相关。研究者不仅揭示了这群细胞的分子特征，更构建了一套名为“预后指数评分（PIS）”的预测系统，像是一张肿瘤内部的“风险地图”，能更精准地预测患者对免疫治疗的反应。这项研究不再满足于传统的分型标签，而是带我们进入肿瘤的微观世界，从细胞层面的“对话”中寻找治疗的新突破口。参考文献：DOI: 10.1016/j.neo.2025.101260一、研究背景乳腺癌仍然是女性中最常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的重要原因。尽管早期检测和多模式治疗策略取得了进展，但复发和转移仍然削弱了长期生存率。非转移性乳腺癌患者的5年总体生存率（OS）可超过80% ，而出现远处转移的患者则骤降至不足25% 。现有治疗手段，包括手术、放疗、化疗、靶向治疗及内分泌治疗，虽可带来一定疗效，但对于持续存在的复发风险仍显不足，尤其是在三阴性乳腺癌（TNBC）中。这凸显了亟需创新治疗方法以改善患者预后。免疫治疗已在多种癌症类型中彻底改变了治疗格局，其中免疫检查点抑制剂（ICIs）发挥了核心作用。乳腺癌治疗领域的一项重要进展发生在2019年，抗程序性死亡配体1（PD-L1）抗体阿替丽珠单抗（atezolizumab）获批用于PD-L1阳性的晚期TNBC。然而，临床反应仍仅限于部分患者，且疗效持续性不佳。例如，阻断PD-1的抗体帕博利珠单抗（Pembrolizumab）在TNBC中的客观缓解率（ORR）为21.4% ；随着后续治疗线的推进，该ORR下降至5.7% 。因此，迫切需要创新方法来识别可能受益于ICIs的患者，因为现有生物标志物，如PD-L1表达及肿瘤浸润淋巴细胞，预测准确性有限。乳腺癌免疫治疗面临的主要障碍之一是肿瘤微环境（TME）的固有复杂性。TME由肿瘤细胞、间质成分、免疫细胞及细胞外基质组成，这些组分的动态相互作用共同塑造肿瘤行为及治疗反应。肿瘤异质性是TME复杂性的关键来源，包括表型、表观遗传、转录组、代谢及微环境多样性。这种异质性驱动免疫逃逸和治疗耐药，成为获得持久免疫治疗反应的重大障碍。尽管整体RNA测序（bulk RNA-seq）提供了关于TME的有价值信息，但其无法解析单个细胞亚群，限制了我们对肿瘤-免疫动力学的理解。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学作为新一代测序技术，革新了以单细胞分辨率解析TME复杂性的能力。这些技术可识别不同的肿瘤亚群及其空间分布，为揭示免疫逃逸及治疗耐药的细胞与分子机制提供了前所未有的视角。本研究采用空间转录组学和单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析乳腺癌异质性复杂性。研究结果显示，基底样乳腺癌（BLBC）是免疫逃逸和不良预后的关键驱动因素。基于基底样标志物，我们构建了预后指数评分（Prognostic Index Score，PIS）模型，有效预测患者风险及免疫治疗反应。这些发现为改进乳腺癌分层管理及个体化免疫治疗策略提供了理论基础。二、研究方法1、转录组数据的获取与处理从TCGA-BRCA数据库获取RNA表达谱及临床数据（n=1097），并等分为训练队列和验证队列。训练队列用于构建预后模型，验证队列用于评估模型的稳定性和准确性。数据标准化为TPM格式并进行log2转换，同时使用SVA包的Combat算法进行批次效应校正。为保证预后模型的稳健性，对训练队列与验证队列的基线临床特征进行了比较，在年龄、肿瘤分期、肿瘤分级及PAM50分子亚型等关键临床病理参数上未观察到统计学显著差异。此外，来自GEO的两个未经治疗的RNA-seq数据集（GSE22093和GSE22513）作为外部验证集使用。2、单细胞RNA测序数据的获取与处理从GEO数据库获取单细胞RNA测序数据（GSE176078），涵盖26例未经治疗的原发肿瘤样本（10例TNBC、5例HER2阳性、11例ER阳性乳腺癌）。数据处理使用R（v4.1.3）和Scanpy（v1.9.1）。细胞筛选标准为：UMI计数200–15000，检测到的基因数200–4500，线粒体基因含量<12% ，血细胞含量<5% 。在识别并标准化3000个高变异基因后，使用BBKNN进行批次效应校正，并采用UMAP进行降维。使用Seurat（v5.0）和FindAllMarkers函数识别差异表达基因（DEGs），阈值为p < 0.05、log2FC < 1、表达频率>30% 。下游分析包括基于Harmony的批次校正和SCTransform标准化。3、细胞注释使用经典标志基因对细胞类型进行注释：上皮细胞（EPCAM, KRT18, KRT19, CDH1）、内皮细胞（PECAM1, CLDN5, FLT1, RAMP2）、成纤维细胞（DCN, THY1, COL1A1, COL1A2）、免疫细胞亚群包括T细胞（CD3D, CD3E, CD3G, TRAC）、B细胞（CD79A, IGHM, IGHG3, IGHA2）、NK细胞（NKG7, GNLY, NCAM1, KLRD1）、髓系细胞（LYZ, MARCO, CD68, FCGR3A），肥大细胞（KIT, MS4A2, GATA2）。在初步分类后，为保证肿瘤细胞群体的纯度，排除所有非上皮细胞（内皮、成纤维及免疫细胞）。肿瘤异质性分析及肿瘤亚型（基底样、HER2+、LumA、LumB、Cycling）识别仅在纯化的上皮细胞群体中进行。上皮亚群注释通过CellxGene数据库（https://cellxgene.cziscience.com）进一步优化。4、预后基因识别使用TCGA数据进行单因素Cox回归分析筛选预后相关基因，共得到50个p < 0.05的基因，并在内部及外部队列中验证，用于构建预后指数评分（PIS）模型。5、肿瘤相关风险特征开发使用101种机器学习算法计算风险评分，并通过surv_cutpoint函数确定最佳分割值。患者按风险评分分为高低风险组，并利用生存学指标评估模型预测准确性。6、机器学习增强的预后模型构建通过综合机器学习流程构建预后模型，以最大化稳健性并最小化过拟合。TCGA-BRCA队列随机分为训练队列（n=548）用于模型构建，以及独立内部验证队列（n=549）仅用于最终一次性评估所选模型。在模型选择过程中，为防止过拟合，采用严格的嵌套验证策略，所有模型开发及算法比较均限于训练集。具体而言，评估来自十种机器学习算法的101种算法组合，包括随机生存森林（RSF）、弹性网络（Enet）、Lasso、Ridge、逐步Cox、CoxBoost、Cox偏最小二乘回归（plsRcox）、监督主成分（SuperPC）、广义提升回归模型（GBM）和生存支持向量机（survival-SVM）。各算法组合性能及超参数通过训练队列的留一交叉验证（LOOCV）调优，该过程提供了每个候选模型的近无偏泛化能力估计。最终选择在内部交叉验证中平均C-index最高的组合作为最终模型。最终模型冻结后应用于独立内部验证队列及外部GEO数据集，以生成所有性能指标，确保结果真实反映预测能力，而非训练数据的过拟合。7、伪时间分析使用Monocle2构建肿瘤亚群的伪时间轨迹，并采用DDRTree进行降维。利用CytoTRACE评估细胞分化状态。8、突变及拷贝数变异分析拷贝数变异（CNV）使用GISTIC 2.0分析，以识别全基因组中重复出现的扩增或缺失区域。肿瘤突变负荷（TMB）通过maftools计算，用于评估每兆碱基肿瘤样本中的体细胞突变总数。随后，将CNV和TMB特征与预后指数评分（PIS）相关联，以评估其与患者结局及肿瘤侵袭性的关联性。9、免疫相关分析利用IOBR整合七种计算方法量化免疫浸润。Estimate R包用于计算间质、免疫及肿瘤细胞比例，并在不同风险组间进行比较。10、整体数据反卷积使用BisqueRNA包及scRNA-seq衍生标志基因推断bulk RNA-seq数据中的肿瘤亚群比例。基于GSVA计算亚型特异性评分。11、免疫治疗反应预测使用TIDE算法对TCGA及GEO数据集进行免疫治疗反应预测。PIS评分在多个数据集（如GSE100797、GSE115821、GSE145996、GSE126044）中用于评估免疫治疗疗效差异。12、空间转录组学数据分析空间转录组学数据从公共库Zenodo获取（https://zenodo.org/records/4739739），选取四个样本进行分析：CID44971、CID4465（TNBC）以及CID4535、CID4290（ER阳性乳腺癌）。为准确解析每个Visium捕获点的细胞组成，并区分肿瘤浸润淋巴细胞与邻近间质细胞，整合高注释的单细胞RNA测序参考数据。利用scRNA-seq数据获得的上皮细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞、成纤维细胞及内皮细胞的转录特征，对空间转录组spot水平数据进行反卷积。13、临床组织采集与处理从五例未经治疗的乳腺癌患者（在泰州大学附属医院行根治性切除术）获取原发肿瘤及匹配邻近正常组织（距肿瘤边缘>3 cm）。手术切除后立即液氮速冻，-80°C保存直至RNA提取。本研究经泰州大学附属医院伦理委员会批准，所有患者在组织采集前签署知情同意书。14、RNA提取与实时定量PCR（qRT-PCR）使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，NanoDrop 2000测定RNA纯度及浓度，A260/A280比值1.8–2.0。1 μg总RNA逆转录为cDNA（PrimeScript RT Reagent Kit, Takara）。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq（Takara）在QuantStudio5系统（Applied Biosystems）上进行，热循环条件：95°C初变性30秒，40个循环（95°C 5秒，60°C 30秒）。基因表达水平以GAPDH为内参，采用2^ΔΔCt法计算，所有实验三重复。15、细胞培养与鉴定所有细胞系均通过短串联重复（STR）鉴定并常规检测支原体污染。细胞在含10% 胎牛血清和1% 青链霉素的DMEM培养，37°C、5% CO₂湿化环境下培养。PIS表达分析在细胞达80% 融合度时采集，按上述qRT-PCR方法检测，实验三重复。16、siRNA转染 PIS特异性siRNA及对照siRNA溶解至10 μM。MCF7及MDA-MB-436细胞在6孔板中播种（2×10⁵细胞/孔），孵育过夜。siRNA与Lipofectamine 3000复合后室温15分钟，加入细胞。转染6小时后更换完全培养基。转染48小时后提取RNA，逆转录生成cDNA，qRT-PCR评估敲低效率，采用2^ΔΔCt法定量，敲低效率>70% （p<0.01, Student’s t-test）。所有实验独立三重复。17、细胞增殖实验（CCK-8）每孔播种3×10³转染细胞于96孔板。转染24、48、72、96小时后加入10 μL CCK-8试剂，37°C孵育2小时。450 nm处测定吸光度，每组5个技术重复，吸光度归一化至0小时生成增殖曲线。18、流式细胞术检测凋亡转染48小时后使用Annexin V-FITC/PI染色评估凋亡。细胞收获、PBS洗涤两次，按Annexin V Apoptosis Detection Kit说明操作，立即用BD FACSVerse流式仪分析。早期及晚期凋亡分别定义为Annexin V+/PI-及Annexin V+/PI+。流式数据使用FlowJo v10处理。19、迁移与侵袭实验使用Transwell（8 μm孔，Corning）评估细胞迁移与侵袭能力。迁移实验中，5×10⁴细胞加入上室无血清培养基，下室含10% FBS。24小时后去除上室未迁移细胞，下室迁移细胞用4% 多聚甲醛固定，0.1% 结晶紫染色，随机5视野计数。侵袭实验中，上室预涂Matrigel（1:8, DMEM），37°C孵育4小时，其余操作同迁移实验。20、蛋白免疫印迹（Western blot）用RIPA裂解液提取总蛋白，加入蛋白酶抑制剂。BCA法测定蛋白浓度。30 μg蛋白SDS-PAGE分离，转膜至PVDF膜。室温5% 脱脂奶粉封闭1小时，4°C孵育过夜一抗：切割Caspase-3（1:1000）、E-Cadherin（1:2000）、Bcl-2（1:1000）、Vimentin（1:1000）、β-actin（1:5000）；HRP二抗（1:5000）室温孵育1小时。ECL显影，ImageJ定量。21、统计分析使用R（v4.1.3）进行统计分析及可视化。分类变量用卡方检验，连续变量用Pearson相关分析。连续变量比较使用Wilcoxon秩和检验或T检验。最优截断值由survminer包确定，Kaplan-Meier生存曲线分析使用survival包。三、研究结果1、单细胞RNA测序揭示乳腺癌肿瘤内异质性为探究乳腺癌的固有肿瘤异质性，我们首先对scRNA-seq数据进行了细胞类型注释，鉴定出主要细胞谱系，包括上皮细胞、免疫细胞和间质细胞。随后，我们将分析重点聚焦于上皮细胞群体，即肿瘤细胞，以避免肿瘤微环境的干扰信号。基于图结构的聚类分析识别出五个肿瘤亚型：基底样（Basal）、HER2+、LumA、LumB和Cycling亚型（图1A-B）。值得注意的是，这些分子亚型呈现的异质性并未被传统临床分型（HER2+、ER+、TNBC）完全捕捉，因为Cycling细胞分布于所有临床亚型中（图1C）。通过ssGSEA进行功能注释显示，各亚型具有独特的通路活性。例如，Basal亚型在免疫相关通路（如炎症反应、补体、干扰素γ反应）中显著富集，与其他肿瘤亚型显著不同（图1D）。2、发育轨迹揭示肿瘤亚群功能层级在鉴定亚型基础上，我们利用Monocle2进行伪时间轨迹分析，探索其发育关系。结果显示三条主要发育分支，Basal和Cycling细胞共享共同轨迹，提示潜在的发育或功能关联（图2A-B）。伪时间基因表达动态显示出明显的早期和晚期基因簇（图2C）。早期基因富集于翻译起始及核糖体亚单位组装，而晚期基因与凋亡信号和细胞外基质组织相关（图2D）。CytoTRACE分析进一步显示亚型的分化潜力，Basal细胞显示最高的可塑性，LumA细胞最低（图2E-F）。这些结果提示肿瘤亚群具有层级组织结构，可能影响其在肿瘤进展及治疗耐药中的作用。3、肿瘤亚群特征、空间分布与患者预后关联为深入理解肿瘤亚群的临床意义，我们在TCGA-BRCA及两个GEO队列（GSE22093、GSE22513）中分析其免疫特征，并通过Combat校正批次效应（图3A-B）。使用BisqueRNA和GSVA计算亚型比例，并通过TIDE算法评估其与免疫逃逸评分的关系。结果显示，基底样细胞与免疫逃逸及预测免疫治疗反应不良最相关（图3C-F）。生存分析进一步显示，高比例Basal样细胞患者的总体生存明显较差（图4A-B），提示其潜在预后价值。空间转录组学分析揭示了显著的肿瘤内异质性，Basal样细胞甚至存在于ER+肿瘤中，说明其在临床亚型中广泛分布，并可能驱动肿瘤侵袭性行为（图4D-G）。4、基底样肿瘤细胞相关预后模型的开发与验证鉴于Basal样肿瘤细胞的强预后相关性，我们基于该亚型标志基因构建了预后指数评分（PIS）模型。在101种算法组合中，Stepwise Cox（前向）+ GBM算法获得最高C-index（图5A）。PIS在TCGA训练、验证及全队列中稳健分层患者风险，高评分始终与较差OS相关（图5B-D）。值得注意的是，PIS在免疫非响应组中较高，表明其能够反映免疫-肿瘤动态（图5E）。此外，PIS在患者风险分层中优于传统临床因素及现有预后模型，显示出更强的预测能力（图6A-B）。5、PIS与基因组变异及肿瘤突变负荷肿瘤突变负荷（TMB）反映新抗原生成，是预测多种癌症免疫治疗疗效的重要标志。本研究分析了PIS与基因组变异（CNV和TMB）的关系。高PIS组患者在1q、8q及17q区域存在显著扩增（图7A）。突变谱分析显示，两组均具有高频突变的TP53（34.2% ）、PIK3CA（33.7% ）及TTN（17.1% ），强调这些基因在乳腺癌发病机制及预后中的关键作用（图7B）。尽管两组在局灶性或广泛染色体增减模式上无显著差异（图7C），但PIS与TMB在log10尺度上呈显著正相关（图7D-E）。Kaplan-Meier分析显示，高PIS且TMB升高的患者总体生存最差（图7F）。这些结果提示，高PIS肿瘤具有更高基因组不稳定性，可能导致其临床侵袭性增强，并降低对常规及免疫靶向治疗的响应。6、PIS与免疫浸润及功能通路富集为进一步解析高低PIS肿瘤的免疫微环境，我们使用七种算法分析了免疫细胞浸润。结果显示，两组均存在较低的初始T细胞及NK细胞浸润（图8A）。对免疫相关基因表达、甲基化及拷贝数变异（CNVs）的进一步分析显示，高PIS组呈现显著的免疫活化特征，尤其免疫检查点基因（如CD274、CD276等）表达升高（图8B）。与ESTIMATE评分的相关性分析进一步验证了这一现象，高PIS与间质评分（Stromal Score）、免疫评分（ImmuneScore）及ESTIMATEScore呈负相关，同时与肿瘤纯度（TumorPurity）呈正相关（图8C）。功能通路富集分析显示，高PIS肿瘤在增殖相关通路中更为活跃，包括核苷碱生物合成及细胞周期（图9A-B）。对Hallmark通路及肿瘤免疫浸润（TIP分析）的综合分析显示，高PIS肿瘤Treg浸润增加，而抗肿瘤免疫细胞较少（图9C）。7、PIS与免疫相关基因及免疫治疗预测我们分析了PIS与免疫相关基因的相关性，以评估其预测免疫治疗疗效的潜力。气泡图显示PIS与多种免疫相关基因呈显著正相关（图10A）。对关键免疫治疗靶点（包括PDCD1/PD-1、CD274/PD-L1、HLA-DPA1及GZMA）的分析显示，低PIS组这些基因表达水平显著高于高PIS组（图10B-E），提示低PIS肿瘤可能具有更有利于免疫治疗的微环境。为了直接评估PIS对免疫治疗疗效的预测价值，我们在四个独立免疫治疗队列（GSE100797、GSE115821、GSE145996、GSE126044）中分析PIS评分。结果显示，在所有队列中，非响应者PIS评分持续高于响应者（图10F-I），提示低PIS患者更可能从免疫检查点抑制剂及其他免疫治疗中获益。8、PIS通过促进增殖、生存及侵袭能力推动乳腺癌进展为实验验证PIS在乳腺癌中的致癌作用，我们分析其表达模式及生物学功能。转录组分析显示，乳腺肿瘤组织中PIS mRNA水平显著高于匹配的邻近正常组织（图11A），提示其可能参与肿瘤发生。我们进一步在乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、T-47D、MCF7、MDA-MB-436、BT-483）中检测PIS表达，其中MCF7和MDA-MB-436表达最高，因此用于后续功能实验（图11B）。通过siRNA在MCF7及MDA-MB-436细胞中敲低PIS，qRT-PCR确认高效沉默（图11C）。CCK-8增殖实验显示，敲低PIS显著抑制细胞增殖，表明其促进乳腺癌细胞生长的作用（图11D-E）。流式细胞术检测凋亡显示，MDA-MB-436细胞PIS沉默后凋亡细胞比例显著增加，提示其具有促生存功能（图11F-G）。此外，Transwell迁移及侵袭实验显示，PIS敲低显著削弱MDA-MB-436细胞迁移和侵袭能力，支持其增强肿瘤侵袭性的作用（图11H-I）。Western blot分析进一步验证了蛋白水平变化：凋亡及上皮表型标志物cleaved Caspase-3和E-Cadherin表达升高，而细胞生存及间质特征相关蛋白Bcl-2和Vimentin表达下降（图11J-K）。四、研究讨论本研究利用scRNA-seq和空间转录组学全面解析乳腺癌肿瘤内异质性。通过对不同肿瘤亚群的分析，尤其是基底样乳腺癌（BLBC）细胞，我们强调其在预后与治疗中的重要作用，特别是在免疫治疗中。肿瘤异质性仍然是乳腺癌的主要挑战，驱动免疫逃逸、治疗耐药及疾病进展。我们的scRNA-seq分析鉴定出五种肿瘤亚型：Basal、HER2+、LumA、LumB及Cycling亚型，每种亚型具有独特的功能及通路活性特征。值得注意的是，这些分子亚型超越了传统临床分类（ER+、HER2+、TNBC），为肿瘤生物学提供了更细致的理解。这种精细分层有助于解释患者间治疗反应的差异。尽管BLBC高表达免疫检查点分子（如CD274、CD276），其认为是“冷肿瘤”，我们的数据表明大多数BLBC患者对免疫治疗无反应，强调需要可靠标志物来识别BLBC并开发个体化治疗策略。最新研究显示，ALIX通过调控PD-L1和EGFR可能成为BLBC的诊断标志物和治疗靶点。此外，我们发现BLBC肿瘤高表达VIM（波形蛋白），这一EMT相关标志物提示其在促进肿瘤侵袭和转移中可能发挥作用，针对VIM或可降低BLBC的转移潜能。定义BLBC亚群的分子特征提供了其侵袭性生物学基础的重要见解。我们鉴定的标志基因——包括VIM、FSCN1、CRYAB和RARRES1——不仅具有相关性，还参与关键的恶性过程。具体而言，VIM在正常乳腺及乳腺癌中认为是干性（stemness）的正调控因子，与Basal样细胞的高度可塑性和自我更新能力相关。FSCN1进一步增强了干性特质，同时驱动侵袭、转移及药物耐受。CRYAB（αB-crystallin）则赋予细胞生存优势，其表达与化疗后Basal样细胞迁移能力增强相关，解释了该亚型的治疗适应性及转移倾向。RARRES1的保留表达可能受亚型特异性机制调控，如启动子低甲基化及维甲酸信号，显示其在不同环境中可能具有肿瘤抑制或适应功能。总体而言，这组基因描绘出BLBC表型的核心特征：内在干性、增强的迁移能力及强大的治疗耐受性，从而解释其不良预后及对常规及免疫治疗的耐药性。这一高度恶性表型与强免疫抑制肿瘤微环境（TME）密切相关。我们的分析显示高PIS肿瘤中Treg显著富集，为其免疫抑制特性提供了关键的细胞机制。这与已有文献一致，Treg募集是侵袭性Basal样乳腺癌的特征，并与不良预后相关。Treg在TME中不仅被动存在，它们主动抑制细胞毒性T细胞功能并分泌抑制性细胞因子，参与免疫逃逸。高PIS肿瘤中免疫检查点的同步升高表明存在协同免疫抑制轴：BLBC细胞在感应T细胞来源的IFN-γ后可上调PD-L1/PD-L2，从而促进Treg分化并进一步抑制抗肿瘤免疫。该自我强化的免疫抑制回路解释了高PIS患者免疫治疗反应差的现象，也提示联合PD-1/PD-L1抑制与Treg靶向策略可能是逆转这一高度免疫抑制肿瘤亚型的有效方法。Cycling肿瘤细胞（CTCs）是早期转移前体，但由于空间和时间异质性，其往往不能代表整个肿瘤特征。伪时间轨迹分析显示CTCs与BLBC存在发育或功能联系。先前研究表明，BLBC中的CTC簇和多克隆转移由CD44+癌症干细胞驱动，与不良预后显著相关。CTCs与循环肿瘤微栓（CTMs）的共现尤其在早期TNBC中被观察到，提示CTMs在转移级联中发挥作用。这强调了分子水平上表征CTCs和CTMs的重要性，以便理解其转移作用并开发靶向干预。近期证据挑战了Basal与Luminal亚型的传统二分法，显示ER+乳腺肿瘤中存在Basal样特征。我们的空间转录组学分析显示，即使在ER+肿瘤中也存在Basal样细胞，提示其在临床亚型中的广泛存在。多组学分析进一步发现HER2+乳腺癌中存在Basal/间质样（HER2-BM）亚型，占20% 以上，对标准抗HER2治疗反应差。这表明Basal样表型是跨亚型的重要致癌驱动因素，可重新定义乳腺癌异质性认知。独立研究也发现部分ER+肿瘤表达Basal标志物（CK5/6、EGFR），进一步复杂化亚型分类。Basal样元素，无论是ER+肿瘤的少量亚群还是整个HER2+分子亚型，都是决定临床行为的关键因素，驱动肿瘤侵袭及对常规疗法的内在耐药。PIS的发展直接应对这一需求，为捕捉这一关键生物学轴提供定量框架，从而为治疗策略提供依据，可突破传统亚型限制，针对肿瘤的Basal样生物学特征进行精准干预，无论其ER或HER2状态如何。尽管本研究取得了重要发现，但仍有局限。我们的分析以转录组为核心，提示需结合蛋白组和代谢组学进一步解析Basal样亚群侵袭性表型的功能机制。此外，免疫细胞浸润解析及PIS模型虽在多队列中严格验证，但受限于基于bulk转录组数据的计算推断。未来研究可通过多组学在更大临床队列中进一步验证PIS的预后价值，并通过功能实验解析Basal样细胞在免疫抑制和治疗耐药中的因果作用。总之，本研究显著推进了对乳腺癌异质性及其免疫治疗意义的理解。通过识别BLBC在免疫逃逸及治疗耐药中的核心作用，并开发PIS模型，我们提供了可操作的精准治疗见解。未来研究应优先整合多组学与空间转录组数据，进一步解析肿瘤异质性，并通过创新治疗策略靶向高风险肿瘤亚群。五、个人观点过去我们常说“乳腺癌异质性强”，却往往停留在临床表型或分子分型的层面，而这项研究通过单细胞与空间空间转录组技术，真正实现了对肿瘤内部“细胞社会”的结构化解析。尤其值得深思的是，基底样细胞即便在ER阳性肿瘤中也有分布，这提醒我们：传统的激素受体状态或HER2表达，并不能完全代表肿瘤的生物学行为。肿瘤内部存在着超越常规分类的“亚型混合体”，而这恰恰可能是治疗失败或复发转移的潜在温床。PIS模型的构建，本质上是在为这种异质性赋予临床意义。它不再仅仅是一个科研意义上的“细胞聚类结果”，而是一个能够衔接基础发现与临床决策的转化工具。尤其是在免疫治疗时代，如何从“冷肿瘤”中识别出可能响应免疫治疗的“热区”，或是在“免疫富集”的肿瘤中警惕那些免疫逃逸的“死角”，PIS提供了一种新的思路。它暗示我们，未来的治疗策略或许不应只盯着肿瘤的“整体性格”，更应关注其内部的“细胞派系”，尤其是那些具有干细胞特性、高可塑性、强免疫抑制能力的基底样细胞群。当然，这项研究也留下了许多待解答的问题。例如，基底样细胞是如何在肿瘤微环境中维持其免疫抑制特性的？其与Treg等免疫细胞的相互作用是否存在时空特异性？PIS模型在不同人种、不同治疗阶段的泛化能力如何？这些问题都需要更多前瞻性临床研究与功能实验的验证。但无论如何，这项工作标志着乳腺癌研究正从“群体战争”进入“细胞级精准干预”的新阶段。它告诉我们，或许未来治疗乳腺癌，不仅需要选择合适的“武器”，更需要一张清晰的“肿瘤内部地图”——而这张地图，正由单细胞技术与人工智能共同绘制。

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