紫杉烷诱导T细胞释放肿瘤杀伤性外泌体

小五

来源:觅健 2024-01-08 09:27:46

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关键词：多西他赛

【Cancer Cell】

原创外泌体小书虫外泌体小书虫 2024-01-08 09:00 发表于天津听全文

紫衫烷类药物是一种常见的化疗药，包括多西他赛（Docetaxel）和紫杉醇（Paclitaxel），在体外细胞实验中，紫衫烷抑制肿瘤细胞有丝分裂，但是在体内的抗肿瘤机制不明确。来自荷兰列文虎克医院的Jacco van Rheenen课题组在《Cancer Cell》发表论文，揭示紫衫烷诱导T细胞，释放肿瘤杀伤性外泌体，是一种全新的非接触式的T细胞杀伤途径。

（文献题目：Taxanes trigger cancer cell killing in vivo by inducing non-canonical T cell cytotoxicity）

此前研究发现，紫杉烷抑制体外细胞有丝分裂，导致肿瘤细胞死亡，为了验证在体内动物实验中，是否存在相同的机制？作者采用两种乳腺癌动物模型，分别是KB1P模型（缺失抑癌基因Brca1和Trp53）和MMTV-PyMT模型（过表达致癌基因PyMT）。

首先采用多西他赛（一种紫杉烷类药物）治疗两种小鼠肿瘤（见下图A），发现两种肿瘤的生长被抑制（见下图B），证明多西他赛对KB1P和MMTV-PyMT存在抑癌功效，但是肿瘤细胞在有丝分裂中期，仍然形成赤道板（见下图D和E），证明有丝分裂没有被抑制，于是多西他赛存在其他抑癌机制。

此前研究发现，只有当肿瘤中存在免疫细胞浸润，多西他赛才能发挥抑癌功效。为了证明多西他赛的功效是否依赖于免疫细胞？作者采用耗竭性抗体（CD4抗体和CD8抗体），在小鼠体内清除CD4+和CD8+ T细胞，然后再采用AC或AC+T治疗（其中AC=阿霉素+环磷酰胺，AC+T=阿霉素+环磷酰胺+多西他赛）（见下图A），实验发现，经过耗竭性抗体处理，肿瘤细胞内不存在任何CD4+或CD8+ T细胞（见下图F和G）。

但是无论小鼠体内是否存在T细胞，都不影响AC（=阿霉素+环磷酰胺）的治疗效果（见下图B），但是对于AC+T（=阿霉素+环磷酰胺+多西他赛）的治疗效果影响很大（见下图C），证明多西他赛依赖于T细胞。AC治疗虽然能够显著抑制肿瘤生长，但是仍然存在小体积肿瘤无法彻底去除（见下图B），但是AC+T治疗能够彻底消除肿瘤（见下图C），显然AC+T（阿霉素+环磷酰胺+多西他赛）效果更好。

为了进一步证明T细胞+多西他赛的功效，作者通过流式细胞仪分选肿瘤中的T细胞，与肿瘤类器官共孵育（见下图D），发现经过AC+T治疗的T细胞可以诱导肿瘤凋亡（Cleaved-caspase 3是细胞凋亡标志物）（见下图E），肿瘤类器官存活率显著下降（见下图F），证明经过AC+T治疗的T细胞可以杀伤肿瘤。

为了细化T细胞的功效，作者分别采用耗竭性抗体，即CD4抗体或CD8抗体，分别清除CD4+或CD8+ T细胞（见下图G），发现两种T细胞都有助于多西他赛的功效（见下图H）。

多西他赛可能存在两种作用机制：（1）直接作用于T细胞，使T细胞杀伤作用增强；（2）直接作用于肿瘤细胞，使肿瘤细胞更容易被T细胞杀伤。为了验证第二种观点，作者先采用多西他赛处理KB1P肿瘤类器官，然后再与T细胞共孵育（见下图A），发现肿瘤细胞并没有更加脆弱（见下图B），证明第二种观点是错误的，多西他赛很可能直接增强T细胞的杀伤功能。

为了验证多西他赛是否能增强T细胞杀伤功能？作者采用多西他赛处理CD4+和CD8+ T细胞，然后与肿瘤类器官共孵育（见下图A），发现肿瘤类器官凋亡显著增加（见下图B），肿瘤存活率显著下降（见下图C），多西他赛直接作用于T细胞，增强其杀伤功能。

为了验证紫杉烷类药物是否普遍增强T细胞杀伤功能？作者选用另一种紫杉烷类药物——紫杉醇（Paclitaxel），和一种非紫杉烷类药物——卡铂（Carboplatin），作为阴性对照。实验发现，紫杉醇处理后的T细胞展示增强的肿瘤杀伤功能（见下图I和K），但是卡铂没有这种效果（见下图J和L），证明紫杉烷类药物普遍能增强T细胞杀伤功能。

一般来说，经典的T细胞肿瘤杀伤功能，是通过T细胞表面受体（TCR）与靶细胞表面MHC-抗原复合物结合，从而活化T细胞，激活免疫反应。但是作者用多西他赛处理T细胞后，T细胞没有展示活化标志物（见下图M），也没有释放细胞因子（见下图N），证明多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞。

为了进一步验证，多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞，作者通过显微镜观察T细胞和肿瘤类器官相互作用，发现经过多西他赛处理的T细胞，使肿瘤类器官周长逐渐减少（=正在杀伤肿瘤细胞）（见下图A和B），但是T细胞始终都没有浸润到肿瘤类器官内部（见下图C和D，无法进入基质胶（BME）的内部），证明T细胞不需要直接接触，也可以杀伤肿瘤，即不依赖经典TCR途径。

为了再次验证，多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞，作者采用淋巴细胞活化抑制剂LCKi，首先为了证明抑制剂LCKi的效果，作者采用表达鸡卵清蛋白抗原OVA肿瘤类器官KB1P，和OT I小鼠的T细胞（可以特异性识别OVA），发现抑制剂LCKi可以显著抑制T细胞的杀伤效果（=抑制依赖于经典TCR途径的肿瘤杀伤）（见下图E），但是对多西他赛处理的T细胞没有一点影响，依然能够杀伤肿瘤类器官KB1P（见下图D-G），也能杀伤肿瘤类器官MMTV-PyMT（见下图H-K），再次证明多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞。

为了再再次验证，多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞（这个结论具有颠覆性，所以需要反复验证），作者采用免疫缺陷小鼠的T细胞，这种T细胞无法激活经典TCR途径，经过多西他赛处理后，依然能够杀伤肿瘤细胞，再次证明多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞。

因为多西他赛不依赖经典TCR途径活化T细胞，所以作者怀疑多西他赛是否能诱导T细胞误杀正常细胞？于是作者选取正常小鼠乳腺上皮细胞MECs作为模型，发现经过多西他赛处理的T细胞，只能诱导一小部分正常细胞MECs凋亡（见下图G），总体存活率较高（见下图H），证明多西他赛对细胞的杀伤具有选择性。

为了验证上述实验结果，是否也适用于人体细胞？作者选取多西他赛处理后的人源T细胞Jurkat，与七种乳腺癌患者来源的肿瘤类器官共孵育（见下图K），发现其中五种细胞出现显著的细胞凋亡（见下图L），将Jurkat细胞与人正常乳腺细胞共孵育（见下图M），没有展示出细胞凋亡（见下图N），证明人源T细胞被多西他赛处理后，也能展示出细胞杀伤的选择性。

然后作者又测试八种人源肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞MDA-MB-231、黑色素瘤细胞A375、肺腺癌细胞A549、胆管癌细胞EGI1、肝癌细胞HEP1和HuH7、直肠癌细胞RKO和神经胶质瘤细胞U251-MG，还包括两种正常细胞，即视网膜色素上皮细胞RPE和胎肾细胞HEK293T，发现被多西他赛处理后的Jurkat细胞，可以显著诱导其中六种肿瘤类器官出现显著细胞凋亡（见下图A-H），两种正常细胞都没有出现显著细胞凋亡（见下图I和J），再次证明人源T细胞被多西他赛处理后，也能展示出细胞杀伤的选择性。

上文揭示被多西他赛处理后的T细胞可以杀伤肿瘤细胞，但是不需要直接接触肿瘤，也不释放经典的细胞因子，于是作者推测，T细胞可以释放未知的细胞毒性因子。于是作者采用KB1P和MMTV-PyMT肿瘤类器官，与多西他赛处理后的T细胞的培养基上清液共孵育，发现即使没有T细胞，也出现肿瘤类器官凋亡（见下图A和C），类器官存活率显著下降（见下图B和D）。

作者首先推测，可能是上清液中的多西他赛杀伤了肿瘤细胞，但是经过实验发现，多西他赛对于KB1P和MMTV-PyMT肿瘤类器官的半数抑制浓度（IC50）很高（见下图A和B），远远高于上清液中的多西他赛浓度（10 nmol/L），证明不是多西他赛杀伤了肿瘤细胞，大概率是多西他赛刺激了T细胞，使T细胞分泌一些肿瘤杀伤因子。

为了进一步证明，不是多西他赛杀伤了肿瘤细胞，作者在肿瘤细胞Hela中过表达ABCB1基因，ABCB1基因编码细胞膜转运蛋白，可以把多西他赛排出细胞外，于是可以耐受这种化疗药物（见下图C）。实验发现，即使ABCB1基因可以排出多西他赛，与上清液共孵育之后，也展示出显著的细胞凋亡（见下图D），存活率显著降低（见下图E），证明多西他赛不会直接杀死肿瘤细胞。

为了找到多西他赛处理后的T细胞上清液中，究竟是什么组分杀伤了肿瘤？作者进行蛋白组学分析，发现很多种蛋白的表达水平上调，其中很多蛋白属于外泌体（见下图E），于是作者从上清液中分离外泌体（EV）和可溶因子（SF）两种组分（见下图F），通过电镜和NTA分别表征外泌体的形态和粒径（见下图H），然后对外泌体（EV）组分进行分析，同样发现很多种蛋白质表达水平上调（见下图G），暗示多西他赛使T细胞分泌更多外泌体。

作者将外泌体（EV）和可溶因子（SF）分别共孵育肿瘤类器官，发现外泌体导致细胞凋亡（见下图H和I），可溶因子不导致细胞凋亡（见下图J和K），证明是外泌体（EV）在杀伤肿瘤。

为了进一步证明上述观点，作者采用超离方法，将上清液中的外泌体（EV-enriched）和可溶因子（EV-depleted）分开，再次发现，外泌体导致细胞凋亡，可溶因子不导致细胞凋亡（见下图J），并且随着外泌体浓度增加，细胞凋亡比例增加（见下图K），进一步证明外泌体导致肿瘤细胞凋亡。

在上述实验过程中，作者发现2D培养的八种人源肿瘤细胞，比3D培养的KB1P和MMTV-PyMT肿瘤类器官，更加耐受T细胞的攻击（=细胞凋亡率较低），为了进一步验证这个观点，作者把基质胶（BME）上面培养的肿瘤类器官洗脱下来，铺在2D细胞平皿中，发现细胞死亡率较高（见下图A和B），这种脱离细胞外基质保护的细胞死亡现象，被称为失巢凋亡（Anoikis），是程序性细胞死亡的一种形式。

存活的细胞经过多次传代，形成稳定的2D细胞，此时细胞死亡率降低（见下图A和B），然后作者测试“2D细胞”（2D cells）和“3D类器官”（3D organoids）对外泌体的耐受程度，发现“3D类器官”很脆弱，而“2D细胞”可以耐受外泌体的攻击（见下图C和D）。

为了排除类器官培养模式（=在基质胶上培养）对耐受程度的影响，作者将“2D细胞”重新放在基质胶上面，模拟类器官培养模式，发现“从2D到3D类器官”（2D to 3D structures）仍然能够耐受外泌体（见下图C和D），证明2D培养的肿瘤细胞，经历失巢凋亡（Anoikis）危机之后，获得一种稳定的特征，可以耐受外泌体的攻击。这里其实在暗示，外泌体对肿瘤的杀伤作用，可能依赖于失巢凋亡（Anoikis）。

上文中证明，经过多西他赛处理后的T细胞对肿瘤的杀伤作用，依赖外泌体，不依赖经典TCR途径，于是作者想要研究，外泌体与经典TCR途径联合起来，是否增强肿瘤杀伤效果？于是作者再次采用OT I小鼠的T细胞（可以特异性识别OVA），和表达鸡卵清蛋白抗原OVA的肿瘤类器官MMTV-PyMT，实验发现，经典TCR途径就可以杀伤肿瘤，而经过多西他赛处理后的T细胞，进一步提高肿瘤杀伤效果（见下图A），证明外泌体与经典TCR途径联合起来，效果更好。

CAR-T疗法是取出患者体内的T细胞，经过体外改造后，回输至患者体内，实现肿瘤杀伤效果（=过继性免疫治疗，Adoptive Cell Transfer Therapy），于是作者也想采用相同的操作，首先将健康小鼠体内T细胞取出，在体外经过多西他赛处理后，回输到荷瘤小鼠体内（见下图B），发现肿瘤生长被显著抑制（见下图C和D），只有一次给药，就使小鼠生存时间显著延长（看下图E和F），证明在体外经过多西他赛处理后T细胞的治疗功效。

为了验证上述实验是否能采用人源细胞重现？作者首先获取肺癌病人的健康组织和肿瘤组织，分别制备成类器官；然后再获取病人外周血单个核细胞（PBMCs），与肿瘤组织共培养一段时间，从而获得可以特异性识别肿瘤的T细胞；然后将T细胞与肿瘤类器官共孵育，观察杀伤效果（见下图A），发现经过处理后的T细胞，对肿瘤类器官杀伤效果更好（见下图B和C），但是对健康细胞无影响（见下图D）。

然后作者将T细胞培养上清液中的外泌体（EV）和可溶因子（SF）分开，分别与三个患者的肿瘤类器官共孵育，发现外泌体可以杀伤肿瘤，但是可溶因子无法杀伤肿瘤（见下图E-G），且外泌体对健康组织无影响（见下图H和I），证明多西他赛可以刺激T细胞释放外泌体，从而杀伤人源肿瘤组织。

总结：紫杉烷类药物是常见化疗药，但是目前不清楚在体内的抗肿瘤机制。本文发现多西他赛不通过经典TCR途径活化T细胞，反而促进外泌体释放，选择性杀伤肿瘤细胞，不影响正常细胞（见下图）。虽然本文没有深入研究外泌体的抗肿瘤机制，但是发现肿瘤类器官经历失巢凋亡（Anoikis）危机之后，就可以耐受外泌体的攻击，暗示外泌体可能通过失巢凋亡来抑制肿瘤生长。因为紫杉烷类药物存在毒性，所以临床给药剂量受到严格控制，本文暗示将患者T细胞在体外经过多西他赛处理后，然后回输T细胞或T细胞来源外泌体，可以实现肿瘤抑制作用，也可以避免紫杉烷类药物的副作用。

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