增殖&细胞周期

争取好好学习的CC 典典柚柚真可爱 2023-08-12 22:38 发表于江苏

MTT 法：MTT 是一种染料，它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中， 而死细胞没有这个现象。DMSO 能溶解细胞中的甲瓒，最后用酶标仪在特定的波长处，测定光吸收值，可间接反映活细胞的数量。MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。后续基于类似的实验原理，还在MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如CCK8 染色实验等等。在做MTT实验的时候，通常取5个时间点（通常就是5天）。把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来，最后形成一条细胞增殖的曲线。通过比较不同处理方式或者不同实验组之间，细胞增殖曲线的高低，就可以判断细胞增殖情况的快慢。

Brdu法：Brdu 是胸腺嘧啶的衍生物， 可以标记活细胞中新合成的DNA，可以代替胸腺嘧啶，选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。这种渗入可以稳定存在，随着DNA的复制，Brdu可以进入子代细胞中。Brdu特异性抗体可以用于检测Brdu在细胞DNA中的渗入，从而判断细胞增殖能力的变化。通常在使用 Brdu单克隆抗体之后，都会结合免疫荧光染色，显示增殖的细胞，同时结合其他细胞标记物，进行双重染色，可以判断增殖细胞的种类，增殖细胞的增殖速度，对研究细胞动力学有重要的意义，因为组织细胞内没有内源性Brdu的存在，所以这种方法用于检测细胞的增殖，应用非常广。另外，通过Brdu染色法可以提供影像学相关的数据，这比单纯采用MTT法（只能提供简单的折线图），要更富有视觉效果。基于Brdu染色方法，又演化出Edu的染色方法。Edu也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶，渗入正在合成的DNA分子中。而且在检测的时候，直接采用荧光染料与Edu特异性反应，直接准确地检测出 DNA 复制活性，能更有效地检测细胞增殖现象。

克隆形成实验的大致流程是，在孔板内加入极低密度的肿瘤细胞悬液，让肿瘤细胞和细胞之间的间隔距离非常地远，近似认为肿瘤细胞之间没有相互联系。经过一段时间的细胞增殖后， 再检测含有50个细胞以上的细胞克隆。所以通过克隆形成实验，可以用于评估肿瘤细胞的离体增殖能力的大小以及肿瘤在体外的致瘤能力的大小。

DNA已经复制完成，因此细胞内染色体数量是四倍体（4N）。PI全称是碘化丙啶。它是插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间并发出荧光。PI 结合的量与 DNA 的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析就可以得到细胞周期各个阶段的 DNA 分布状态，从而计算出各个细胞周期时相的百分含量。