Nat Imm | 肿瘤抗原的早期数小时接触决定T细胞耗竭命运

原创 傅坤元 图灵基因 2023-08-18 10:21 发表于江苏

撰文：傅坤元

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亮点：

1. 肿瘤特异性CD8+ T细胞的细胞耗竭发生于T细胞分裂之前，肿瘤抗原刺激时间越久，耗竭印迹越深；

2. 肿瘤抗原刺激T细胞产生一系列表观遗传学和转录组学改变，而这种早期变化与晚期耗竭T细胞的改变类似。

第一部分 背景介绍

Part One  ──────────────────

2023年8月3日，通讯作者Mary Philip博士在《Nature》子刊《Nature Immunology》发表了题为“Hallmarks of CD8+ T cell dysfunction are established within hours of tumor antigen encounter before cell division ”的文章。

急性感染期间，CD8+ T细胞可发生完善分化，并获得产生效应细胞因子（如IFN-γ和TNF）和细胞溶解分子（如GZMB和PRF1）。而慢性感染过程和进展期肿瘤中，由于抗原持续刺激，CD8+ T细胞的效应功能和增殖能力丧失，抑制性受体（如PD-1和LAG3）上调，最终发生细胞耗竭。

以往研究已经发现，只要与肿瘤抗原接触数天，T细胞功能障碍就会发生。多细胞动物为了确保足够的细胞数量和器官功能，其细胞的增殖和分化必须受到精细的调节。急性感染时，24小时的抗原刺激就足以使CD8+ T细胞大量增殖，分化为效应细胞和记忆细胞，且不再依赖于抗原的指导作用，相当于“自动驾驶”。这种“自动驾驶”的分化表明，抗原刺激后的最初24小时是决定CD8+ T细胞命运的关键时机。

然而，肿瘤特异性CD8+ T细胞（TST）究竟是如何激活，随后又是如何耗竭的呢？肿瘤细胞是否发生类似“自动驾驶”的分化，从而驱动T细胞进入失调状态？带着这些疑问，Mary Philip博士团队开展了一系列研究。

第二部分 结果解读

Part Two  ──────────────────

1、肿瘤抗原早期刺激T细胞失能化增殖

为了确定增殖分化到功能或功能失调状态之间的关系。SV40大T抗原（TAG）特异性初始CD8+ T细胞经过CFSE标记，示踪细胞分裂，并转移到TAG激发的自发性肝癌小鼠模型或表达TAG的李斯特菌感染的C57BL/6小鼠模型。

肝癌（T）和感染（E）的小鼠模型中，T细胞的分裂均十分旺盛（60小时内数量增加6倍余），活化标志物CD69和CD44均上调，TCR信号通路上调。

令人惊讶的是，肝癌小鼠模型的肿瘤、肿瘤引流淋巴结和脾脏中的T细胞免疫表型变化相同，具有强大的增殖分化能力，但是体外TAG的再刺激反应中，T细胞完全不能产生IFN-γ和TNF，早在分化的第1阶段就会出现这种功能丧失。这与感染小鼠模型的T细胞形成鲜明对比。因此，肿瘤抗原刺激驱动了CD8+ T细胞活化和增殖，但是不让CD8+ T细胞获得效应功能。

2、肿瘤早期启动T细胞失能化

鉴于TST效应细胞的功能损伤只在少数细胞分裂时比较明显，本研究接下来探讨了细胞分裂前抗原激活后的分化情况。

肝癌小鼠模型的T细胞在接触抗原6小时内激活，与感染小鼠模型相似，表现为CD44、LAG3和PD-1上调。感染小鼠模型的T细胞早期即可产生效应细胞因子，而肝癌小鼠模型的T细胞在抗原刺激后6小时后，TNF和IFN-γ的产生能力下降，12 小时后几乎完全无法产生，也无法产生颗粒酶B（GZMB）。可以说，肝癌小鼠模型的T细胞收到抗原刺激后，数小时即发生的多种效应功能的损伤。

TOX是一种DNA结合蛋白，作为2019年《Nature》的明星分子，多项研究都表明TOX与肿瘤细胞功能障碍和病毒感染的细胞耗竭有关。本研究则发现，抗原刺激后的早期阶段并无TOX的产生，说明TOX不介导早期T细胞的效应功能损伤。

肿瘤这么快地产生T细胞功能障碍可能仅由于免疫启动不足，为了排除这种可能性，本研究测试了在肿瘤诱导的失能面前，效应T细胞是否还能保持其功能。感染小鼠模型的第5天效应分子TCRTAG（E5d），经过CFSE标记，转移到肝癌小鼠模型（E → T）和对照感染模型小鼠（E→E），并在12小时、36小时和7天后进行分析。

结果证明，E5d是执行记忆分化的功能性效应因子，不受肝脏微环境的负面影响。E→E在受体感染小鼠模型的肝脏和脾脏中重新表达CD127，并持续产生IFN-γ和TNF。相反，E→T在转移后，T细胞虽有增殖，但12小时内就会开始丧失产生细胞因子的能力，至7 天后完全丧失。E→T表现出的功能障碍有着经典的分层过程，首先受到影响的是TNF，然后是IFN-γ。值得注意的是，几乎所有的效应功能丧失都发生在细胞分裂之前，说明细胞分裂并不驱动效应功能的丧失。

3、TST与转移性黑色素瘤

其他组织的肿瘤具有不同的抗原特异性，TST效应功能的早期丧失是否还是会发生呢？本研究使用了肺转移的黑色素瘤小鼠模型，也是构建了肿瘤和感染模型。构建融合EGFP的卵清蛋白（OVA）部分序列的小鼠黑色素瘤细胞，静脉注射至小鼠体内。然后构建转基因初始CD8+ T细胞，使之能够识别OVA。

结果表明，即便是在不同的组织内，抗原特异性不尽相同，但是肿瘤抗原总能够使T细胞早期失能。肿瘤和感染模型的T细胞在第一次细胞分裂前迅速激活，CD69和PD-1大量产生。48小时，T细胞的增殖均十分旺盛，CD44和LAG3表达上调。尽管肿瘤模型的T细胞增殖，但不能产生TNF和IFN-γ ，只产生极少的GZMB。相比之下，感染模型活化后16小时即产生TNF、IFN-γ和GZMB，并随时间延长而功能增强。

本研究开展了与肝癌模型类似的E5d转移，结果与前一实验相同。转移后的24小时内，大多数细胞尚未完成分化时，E→T的T细胞就开始丧失产生TNF和IFN-γ的能力，而E→E则保持其功能。

这些发现表明，TST功能障碍的早期发生并不是肝脏肿瘤及其微环境所特有的，而是可以发生在不同组织的其他癌症中。

4、细胞分裂前的表观遗传改变

前面的实验结果表明，TST在细胞分裂之前就会产生丧失其效应功能。那么，功能障碍相关的表观遗传重塑是否也发生在细胞分裂之前呢？

ATAC测序和RNA测序的主成分分析（PCA）表明，肿瘤和感染模型的T细胞具有不同的染色质可及性和基因表达谱。值得注意的是，抗原刺激后的6小时内更集中地发生了染色质重塑，随后发生的变化较少。肿瘤和感染模型共享64%的差异可及染色质峰，包括TCR信号下游基因（Irf4、Nfatc2、Nfkb1、Lat）。

Pdcd1包含一个位于转录起始位点上游23 kb的增强子峰（-23kb），肿瘤晚期功能失调和细胞耗竭的T细胞和慢性病毒感染时，Pdcd1优先打开。值得注意的是，肿瘤抗原刺激T细胞的6 h内，耗竭相关的Pdcd1峰可及性较高。

驱动早期染色质重塑差异的转录因子有哪些？ChromVar25对肿瘤和感染模型的DAC进行了基序分析，发现感染模型与炎症因子诱导的转录因子相关的基序（如STAT家族）优先富集，与李斯特菌诱导的天然免疫激活一致。含有STAT1基序峰的上调基因包括细胞因子受体（Il12rb）和炎症相关基因（Oasl1）。

另一方面，TST的NFAT 转录因子家族基序在DACs中富集。本研究团队之前的研究表明，晚期NFAT驱动多种抑制性受体以及转录因子TOX17的表达。与急性感染的T细胞相比，TST的NFAT活性变化更早可能是由于NFAT的转录因子组合不同，或基因组位置差异。

肿瘤和感染模型的T细胞接受了类似的TCR刺激，然而，肿瘤刺激下的T细胞无法接收到炎症细胞因子信号。基因集富集分析（GSEA）显示，早期感染模型T细胞富集IFN-α和IFN-γ应答相关的基因，与DACs中STAT转录因子基序富集一致。相反，早期肿瘤模型T细胞富集无各炎症信号通路。

细胞分裂前，肿瘤和感染刺激的T细胞转录情况是否发生改变？早期感染模型的T细胞富集与急性感染后期效应细胞（第6天）和记忆T细胞（第30天）的基因富集情况相同。相反，早期肿瘤模型的T细胞（第5至30天）与晚期功能丧失或耗竭T细胞相关的基因富集情况相同。同时，早期肿瘤模型的T细胞高表达T细胞功能负调控因子（Rgs16、Pdcd1、Ptpn22）、炎症相关基因（Mx1、Isg15），低表达功能分化相关转录因子编码基因（Batf、Tbx21）。

总之，肿瘤抗原早期即可刺激T细胞，产生一系列表观遗传学和转录组学改变，而这种早期变化与晚期耗竭T细胞的改变类似。

5、肿瘤抗原刺激随时间加深染色质重塑

细胞分裂前，T细胞功能丧失相关的染色质可及性改变是否随抗原刺激的持续时间延长而变化？

根据肿瘤暴露时间，PCA分析结果将TST染色质可及性的分为3组：早期（6至24小时）、中期（5至10天）和晚期（14至60天后；图6a）。恶性肝脏病变与癌前病变的肿瘤小鼠模型的第5天效应分子TCRTAG（T5d）具有相似的染色质可及性。TST的DAC集中变化于6 h内，在24小时和5天之间又发生了第二轮较大的变化，在7天和14天之间发生了第三轮较小的变化，之后几乎不再发生染色质重塑。E5d则无第三轮染色质重塑。因此推测，第三轮染色质重塑是由持续的肿瘤抗原刺激所驱动的，表明在抗原清除的第5天就基本塑造了记忆细胞相关的染色质状态。

本研究通过早期过渡期间和中期过渡期间中每个峰的可及性的变化，比较了单个DAC随时间的变化。“强化开放”象限的一个峰值在早期过渡期间的可及性增加，并在中期过渡期间进一步增加。相比之下，“稳定封闭”象限中的一个峰值出现在可及性下降的早期，并在后期的转变过程中保持封闭。

分析发现，TST的36%的分裂前重塑峰在持续的肿瘤抗原刺激下保持稳定（19%关闭，17%开放），随着时间的增加（13 %）或在中间过渡期间开放（16 %）。因此，近半数的T5d染色质可及性标志在肿瘤抗原刺激后的6小时内就已经建立。这与感染模型的T细胞分化形成鲜明对比，许多感染模型早期DAC是短暂的（51%），或在中间过渡期间之间新出现（19%)。

Pdcd1位点体现了这些模式，与PD-1表达一致。功能丧失和细胞耗竭相关的Pdcd1增强子峰只在肿瘤早期开放，后期得到加强；+4.5 kb峰在感染期间短暂开放，在肿瘤中保持稳定开放；+10 kb的峰只在肿瘤的中间时间点开放。

TST分化过程时，究竟是哪些转录因子决定了峰的变化？monaLisa分析显示，肿瘤和感染模型的T细胞瞬时开放的峰（浅紫）具有相似的转录因子，但NFAT转录因子基序在肿瘤中特别富集在增强（浅橙）和中晚期（深橙）的峰，而感染模型无该情况。这与抗原刺激持续时间的差异相一致。

相比之下，T-box转录因子家族基序（TBX21和EOMES）在早期开放的峰中有较多富集，感染过程中主要增强（浅橙），但肿瘤较少。这是由于在急性感染过程中，这些转录因子能够促进T细胞的效应功能和抗原记忆作用。

6、肿瘤抗原刺激的时间决定T细胞失能程度

T细胞的染色质可及性变化随着抗原刺激时间的增加而增强，那么肿瘤的T细胞转移到无瘤机体后，T细胞是否还会保留失能的免疫表型和表观遗传特征呢？

本研究取诱发肿瘤后1、5和10天（T24h、T5d和T10d）的肝癌小鼠模型的T细胞，并注射至无瘤小鼠，停留1、5和10天（P24h、P5d和P10d）再取出。

结果发现，直接从肝癌模型小鼠取出的T细胞不能产生细胞因子。在无瘤小鼠体内停留1至5天后，PD-1表达持续下调，但仍有近三分之一的细胞不能产生TNF或IFN-γ。随着肿瘤抗原刺激时间的延长，为更多的T细胞打上了“印记”，其效应功能的丧失，几乎所有的T10d都不能产生细胞因子，PD-1持续高表达。

评估染色质可及性时，本研究发现：无瘤小鼠体内停留前后的记忆T细胞聚类存在差异。本研究继续使用类似于图6c所描述的散点图分析，表征停留前后DAC变化。T24h许多峰变化都较短暂，P5d后恢复，稳定的峰较少。然而，随肿瘤刺激时间的延长，瞬时峰的数量减少，稳定峰的数量增加。相应地，随着肿瘤暴露时间的延长，停留后T细胞的Pdcd1增强子的染色质可及性增加。相比之下，停留后T细胞的TOX表达持续丢失，这表明TOX表达依赖于更长时间的抗原刺激。

T细胞逐渐丧失功能的印记是由谁烙上的呢？本研究探讨了转录因子的基序富集在停留前后DACs的变化。停留后，开放染色质峰显示CTCF基序富集。近有研究表明，CTCF介导的基因组重组可促进CD8+ T细胞效应分子的分化。NFAT转录因子家族富集在中期增加，在肿瘤切除后丢失，表明NFAT介导的DACs需要持续的TCR信号维持。

停留后的样本更接近记忆性T细胞（图7e、f），而两者都不再受到抗原刺激。然而，抗原再刺激时，记忆性T细胞能够产生高水平的TNF和IFN-γ，停留后的T细胞则丧失了产生细胞因子的功能。记忆性T细胞富集了记忆性相关的TCF1和ZEB家族基序，而P5d缺乏此类富集。

教授介绍

通讯作者Mary Philip博士任职于范德比尔特大学医学院，是病理、微生物与免疫科助理教授。其团队长期从事T细胞相关的抗肿瘤研究。

参考文献

Rudloff, M. W., Zumbo, P., Favret, N. R., Roetman, J. J., Detrés Román, C. R., Erwin, M. M., Murray, K. A., Jonnakuti, S. T., Dündar, F., Betel, D., & Philip, M. (2023). Hallmarks of CD8+ T cell dysfunction are established within hours of tumor antigen encounter before cell division. Nature immunology, 10.1038/s41590-023-01578-y. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/s41590-023-01578-y