基因检测的那些事(二)

近年来，针对免疫检查点的免疫治疗发展迅速，受益的病人越来越多。然而由于临床审核的滞后，在国外有些病人接受免疫检查点抑制剂治疗还不能被保险覆盖。国内的这类病人如果自费的话，可以明显受益。那么，如何选择检测方法发现受益人群呢？如何正确理解相关结果和临床反应呢？回答这个问题需要从一下几个方面讲起:

1): T细胞介导的细胞免疫

人体的免疫系统主要通过T细胞介导的免疫反应杀死肿瘤细胞。在这过程中，T细胞需要识别肿瘤细胞。正常的免疫系统是如何识别哪些需要攻击，哪些不需要攻击呢？这个功能是在胚胎时期建立起来的。通俗地讲，胚胎时期免疫系统接触过的都会被认为是自身的，不会被攻击，否则会被认为是外源性的，会引起免疫反应。这是免疫系统成熟过程中克隆tichu剔除引起的。

例如男性免疫性不孕，可由血睾屏障破坏并导致免疫系统接触到精子或睾丸内组织，引起免疫攻击所致，而血睾屏障健全时是接触不到免疫系统的。外伤和年幼时期的严重腮腺炎都是破坏血睾屏障的原因。

对于肿瘤细胞来讲，如果其表面有供T细胞识别的异常的蛋白分子(可由突变引起)，就很容易诱导免疫攻击。如果表面的异常蛋白分子展示的不够充分或异常蛋白质分子只包裹在细胞内，T细胞接触不到，就不会引起免疫攻击，表现为免疫耐受。同时，即使能够被识别，也需要一系列的信号通路上的分子和其它细胞参与才能完成免疫攻击，如果上诉任何环节异常，均可以影响免疫攻击。

放化疗可以导致肿瘤细胞死亡破裂，释放内部或细胞表面展示不充分的异常蛋白质，致敏免疫系统，同时放化疗在直接杀死一些部分肿瘤细胞都同时可使另一部分肿瘤细胞水肿变性，细胞通透性增加，细胞表面的某些异常蛋白质展示更充分，引起免疫攻击。这就是为什么放化疗可以对免疫治疗的起增效作用。肿瘤细胞中的突变数目(TMB)越多，可致敏的蛋白分子也可能也多，免疫治疗有效的可能性也越高。因此，TMB高也是免疫检查点抑制剂治疗的指标之一。

当T细胞对肿瘤细胞产生免疫攻击时，会释放很多不同的细胞因子包括驱化因子，吸引更多的炎性细胞聚集。与此同时，这些因子会产生肌肉骨骼酸痛等非特异症状。这些因子也可以由其它原因引起，并不一定代表针对肿瘤细胞的免疫治疗起效。这在后面会提到。

2):针对免疫检查点的免疫治疗

目前主要有效的免疫治疗手段之一是针对免疫检查点的免疫治疗。

首先需要弄清楚两个蛋白质分子，PD1和PDL1，前者叫细胞程序性死亡蛋白1，一般表达在T细胞上。后者是细胞程序性死亡蛋白配体1，一般表达在肿瘤细胞上。两者可以结合。当T细胞和肿瘤细胞通过这两个蛋白分子结合时，就会抑制T细胞对肿瘤细胞的免疫攻击。然而，这只是肿瘤细胞免疫逃逸的方法之一。如果免疫逃逸是这种原因造成的，用PD1抗体或PDL1抗体就可以阻断PD1和PDL1的直接结合，复活T细胞免疫。这就是免疫检查点抑制剂的免疫治疗原理。

由于PD1和PDL1是蛋白质，因此临床上用免疫组化来检测。由于肿瘤组织取材相对容易，针对肿瘤细胞上的PDL1的检查比较成熟普遍，而PD1比较困难。在临床上被批准的用于检查PDL1的免疫组化抗体有五种，而每种的特异性和敏感性并不一样，也就有说可能出现用一种或几种抗体阳性，但用另一种或几种却阴性的现象。因此，临床上有PDL1阴性，用免疫治疗有效的病例。另外， 还有一种配体PDL2，也表达在肿瘤细胞上并与PD1结合，起到类似作用。这些肿瘤细胞的PDL1检测当然也阴性，而免疫治疗对其中的一些病人也有效。

临床上用于免疫治疗的五种药物都是抗体，它们本质上是一种蛋白质，比如pembroilzumab是一种人源化的老鼠单抗，因此有一定的免疫原性，它本身可以引起免疫反应，释放细胞因子，诱发免疫反应，表现为皮疹，发热等，更轻微的可表现为肌肉骨骼酸痛，这些与T细胞免疫攻击肿瘤细胞产生的非特异性症状相似。

由于这些抗体是蛋白质，有一定的半衰期，如pembroilzumab的半衰期是25天，这就是为什么三个星期给药一次的原因之一。间隔过长，药物浓度过低， 很多T细胞就不能被解放出来攻击肿瘤细胞。

3): TMB和其它相关基因

临床上有越来越多的研究发现TMB高的病人接受免疫检查点抑制剂治疗后能获得很好的疗效，并做为选择病人接受免疫治疗指标。其深层次的机理还在探索中。但有一点是肯定的，TMB高会导致能被T细胞识别的异常蛋白分子大大增多，使肿瘤细胞受到T细胞的免疫攻击的可能性大大增加。而且，无论哪种类型肿瘤，TMB高的肿瘤都会对免疫治疗有较好的效果。如恶性黑色素瘤，除了年轻病人，高TMB非常普遍，因此免疫治疗效果普遍常好。恶性黑色素瘤多由紫外线引起的，高TMB跟阳光中的紫外线的致突变有关。

无论肿瘤细胞还是正常细胞，在分裂的时候需要DNA复制。在DNA复制过程中，由于DNA合成酶的缺陷，出错是非常普遍的。正常情况下，有大量不同的修复酶的存在，绝大多数的错误可以被修复。即使少量不能被修复，也会有一些基因把控，诱导这些细胞死亡。可是，一旦这些基因中的某个或某些出现突变，丧失功能，TMB就大大增加。如与错配修复(MMR)有关的基因突变，TMB可升高到30-40Mut/Mb(不同的检查方法数值可能不同)，而POLE和POLD1基因中的矫正区域的突变可导致TMB高达100以上。如果MMR中的一个和POLE或POLD1的矫正区域同时有突变，TMB可高达几百。因此，临床上已经开始对有MMR，POLE和POLD1突变的病人给予免疫治疗，并取得了令人鼓舞的疗效。

MMR包括一组基因，比较重要的有:MLH1, MSH2, MSH6 和PMS2。另外还有一些相对少见的基因。虽然这些基因的突变在结肠直肠癌中最常见，然而无论哪种肿瘤，一旦有突变，预示免疫治疗很可能有好的疗效。

这些基因突变可通过二代测序检出。然而MLH1, MSH2, MSH6 和PMS2四种基因突变导致的活性丧失也可由免疫组化检出，而且免疫组化还可以发现由这四个基因突变以外的其它因素导致的功能丧失，特别是特异性和敏感性都不错。比较大的医院病理科都应该可以做这个检查，费用不高，只是需要组织块标本。因此，没有条件做测序的病人可以做免疫组化。相反，目前的POLE和POLD1的免疫组化的特异性和敏感性不高，没有临床应用价值。值得注意的是POLE和POLD1的研究开始还不太久，突变数据库还不健全，尤其是有关这两个基因的矫正区域以外的突变的作用还在研究中，解读这两个基因的突变要谨慎。

还有一些基因，它们的突变与其它的一些DNA或染色体变异类型有关，不像上述几种基因。它们与免疫治疗相关性不大，不一一列举。

总之，根据病人情况选用恰当的方法采取标本，并根据经济能力和已有的检查结果选择检测方法，目的是尽可能为治疗方案的制定提供可靠的依据。

Summary

a) 二代大panel测序贵，但能提供靶向治疗的信息，并提供TMB和MMR，POLE和POLD1等突变数据为免疫治疗选择提供依据。另外，还可以了解耐药基因和免疫超进展基因的情况。

b) 只针对有限基因的测序比较便宜

c) PDL1和PD1依靠免疫组化

d) 四个MMR基因的免疫组化检测便宜，并能发现基因突变意外的异常导致的MMR基因功能缺失。

e) POLE和POLD1要靠测序，突变解读要谨慎。

f) 全血标本测序容易出现假阴性

g) 组织标本测序的丰度可能并不代表整个肿瘤组织的丰度

h) 转移灶和原发灶的突变谱可能不一样。甚至不同部位脏器的转移灶的也不一定一样。

i) 全血标本采血时与上一次治疗的间隔越长越容易出结果