EML4-ALK融合基因突变的前世今生

■ 写在前面：
分子生物学是一门抽象而严谨的自然科学，涉及的概念和原理艰涩难懂，所以援引网络图片简易描述，以此抛砖引玉，了解肺腺癌ALK阳性病发原因，癌细胞的生成和转移，避免抗癌路上走弯路。因水平有限，有谬误之处，请各位大咖批评指正。

先讲重点，概述肺腺癌EML4-ALK融合基因突变的致癌机制：癌变发生在肺部细胞微环境中，ALK基因位于体细胞2号染色体短臂位置，通常在人体胚胎期特定组织中活跃表达，通过细胞内转录翻译合成ALK蛋白，接受到组织信号和胞外配体后，激活胞内下游信号通路，促进细胞分裂增殖。ALK在特定时期特定组织行使完功能后即被关闭，成人体内ALK处于休眠状态，亦不表达蛋白。当细胞受损或外界条件诱导时，发生基因突变，临位EML4基因断裂倒位插入ALK20号外显子位置，生成新的EML4-ALK融合基因，该基因合成的EML4-ALK蛋白可以在不接受组织信号和配体的情况下，异常激活下游信号通路，在抑癌基因失活的同时，促使细胞不断增殖，人体发生癌变。

一. 从细胞到基因

❉ EML4-ALK融合基因突变发生的位置：

❉ 人体：人体由一个受精卵细胞不断分裂和分化而成。“分裂“使细胞数量增加，成人体内细胞约有40万亿~60万亿个，一个正常细胞最多分裂50-60次后凋亡。“分化“使不同器官的细胞具有特定的形态和功能，细胞是构成人体的基本单位。

❉ 肺部：肺部细胞图。【图中的洞穴是肺气泡，是血液交换气体的地方】

❉ 细胞功能：每个细胞就像一个化工厂，不停的进行着各种能量代谢和信息传递。

❉ 细胞结构：细胞结构如下图所示，除成熟的红血球和血小板外，所有细胞都至少有一个细胞核，细胞核是调节细胞生命活动的控制中心。

❉ 细胞核：人体细胞核中有23对（46条）染色体【染色体是成对的，在细胞分裂时很容易被碱性染料染色，所以取名染色体】，染色体由DNA和蛋白质构成，是基因的载体和重要的遗传物质。人体的第23对染色体是性染色体，染色体是XY是男性，XX是女性。肺腺癌EML4-ALK融合基因突变发生在核内第2号染色体。

❉ 染色体：单个的染色体形态如下图所示，EML4-ALK融合基因突变发生在2号染色体短臂位置。

❉ 染色体和DNA：染色体是DNA的载体，每个染色体含有1个或2个DNA。

❉ 染色体和DNA：染色体是由DNA多级缠绕折叠而成，拆解染色体得到DNA，如下图：

❉ DNA和基因：DNA为双链螺旋结构，DNA的大部分片段是重复序列和非编码区，其中带有遗传讯息的DNA片段称为基因，人类基因组大约有2-3万个基因。

基因有两个特点：1.基因可以完整的复制自己，以保持生物的基本性状。2.在正常条件下或外界条件的诱导下，基因会发生变异。

❉ 碱基：把基因的双螺旋打开，如图所示，每个基因含有成百上千个脱氧核苷酸（碱基）

❉ 碱基序列：人类基因组含有约31.6亿个DNA碱基对，基因中四种碱基A/T/C/G的排列顺序代表着遗传信息，基因通过不同的碱基排列顺序储存着生命的全部信息。

❉ 基因的表达：即基因合成蛋白。细胞核中的基因把碱基序列转录到RNA上，RNA通过核孔进入到细胞质中，在细胞质中完成蛋白的合成，基因信息翻译的过程中，每相邻的3个碱基序列会合成一个氨基酸，多个氨基酸形成肽链，多肽折叠成为蛋白质，构成人体。基因都是通过其合成蛋白作用于人体，EML4-ALK融合基因即通过其合成的蛋白，使细胞发生癌变。

❉ EML4-ALK融合基因发生位置：在人体肺部细胞>细胞核中>2号染色体短臂位置>DNA上的ALK基因和EML4基因位置。

二. ALK基因和EML4基因

❉ ALK基因在2号染色体DNA的2区1带，EML4基因在DNA的2区3带，两个基因相隔约10MB距离。

❉ ALK基因：ALK基因主要在胚胎期表达（合成蛋白质），促进神经细胞增殖，在脑和外周神经系统的发育过程中起作用。当神经系统发育完善后，通常进入休眠状态。人体细胞基本不表达ALK，如果ALK基因在错误的时间，错误的部位表达出来，便会引起疾病。

❉ ALK基因的表达--合成ALK蛋白：ALK基因通过细胞内的转录和翻译，在细胞质中调控合成了ALK蛋白，该蛋白是一个跨膜的、酪氨基激酶的单体，合成后会被tRNA转运至细胞膜上。ALK蛋白的N端露在细胞膜外面，N端的功能是接受外界配体的信号。中间段是跨膜部分。C端位于细胞内，是有酪氨酸激酶功能的结构功能域。

野生的ALK蛋白，2个蛋白单体组成一个ALK的二聚体，经过配体的激活，二聚体的两个亚基之间相互磷酸化，二聚体变成有激酶活性的酪氨酸激酶。即二聚体与这些配体结合之后，就被激活（磷酸化），然后激活下游信号通路当中的因子，促进细胞增殖。

❉ EML4基因的表达--合成的EML4蛋白结构：

EML4由N端Basic区，HELP域，WD-重复区构成，其中Basic区和ALK二聚体化有关，去除Basic区可使EML4-ALK融合蛋白的催化活性大大减低（84%），因此Basic区可能是EML4-ALK融合蛋白产生效应的关键区域。Basic区靠近N端包含有一段螺旋卷曲，全部由EML4的2号外显子编码，成为CC区，它可能是Basic区内参与EML4-ALK二聚体化的主要基序。

三. EML4与ALK的融合和癌变

❉ 基因突变：

1.原癌基因：在正常情况下，细胞内存在着与癌症有关的基因，这些基因的正常表达是个体发育、细胞增殖、组织再生等生命活动不可缺少的，这些基因只有发生突变时才有致癌作用，变成癌基因。这些具有引起细胞癌变潜能的基因称为原癌基因

2.抑癌基因：细胞中还存在另一类基因与遏制细胞增殖有关，这类基因的缺失或失活，也可引起细胞癌变，这类基因叫做抑癌基因

3.致癌因子：3.1.外因：物理致癌因子（高能辐射）；化学致癌因子（环状化合物，亚硝酸）；生物致癌因子（HPV,HBV，幽门螺旋菌，黄曲霉素）。3.2.内因：遗传，免疫，种族，性别，年龄，激素等；

❉ 癌变机制：

每个基因都有概率发生自然突变，在致癌因子诱导下基因也会发生突变。正常细胞在多次突变的共同作用下才能诱发癌变。

细胞由于物理、化学、病毒等致癌因子导致的原癌基因和抑癌基因同时发生突变而转变为癌细胞。【此处可以理解为ALK为原癌基因，在致癌因子作用下发生融合突变，同时TP53等抑癌基因也发生突变失活，则正常细胞转变为癌细胞】

❉ 基因突变：EML4-ALK融合：

❉ EML4-ALK融合：

EML4与ALK的基因序列在2号染色体短臂上方向相反,相隔12 Mb，融合时须二者之一反向与对方相接。

❉ EML4-ALK融合基因亚型：

ALK和EML4融合时，所有ALK基因融合都发生在20号外显子编码的一段序列，而EML4断裂点则表现出多样性，已经检测到的断裂点有2/6/13/14/15/17/18/20号外显子，形成多种EML4-ALK融合基因型，它们中大部分被证实有促进肿瘤生成的活性。【比如：基因报告在ALK阳性后标记有E6:A20，则为V3亚型，各亚型对抑制剂的耐药性有差异】

❉ EML4-ALK致癌的原理：

ALK和EML4的融合基因能够产生一种具有致瘤活性的融合蛋白即EML4-ALK融合蛋白，该蛋白由EML4的氨基末端与ALK的胞内近薄膜部分的激酶域结合所形成，EML4的氨基末端部分对ALK激酶域的本构二聚作用，导致下游信号通路如AKT,STAT3和膜外信号调节激酶1和2(ERK1/2)的异常激活，使细胞增殖，永生化和骨架及外形的改变。

❉ 信号通路：

对于ALK基因来说，产生融合基因突变，是很重要的一种致癌基因突变形式。目前已知，

突变的ALK蛋白所参与的激活的下游信号通路十分广泛。现在已知它会参与的信号通路有：RAS-MAPK通路，PI3K-AKT通路，PLCγ通路，JAK-STAT通路以及多个其它通路，这些信号通路，最后都是导向：细胞增殖、抵抗凋亡、促进血管生成，最终会诱发癌症。

❉ 肺腺癌主要驱动基因的信号通路：

四. 癌细胞

❉ 癌细胞：可以无限增殖的变异细胞【简易描述】

❉ 电镜下的癌细胞形态：

❉ 正在分裂的癌细胞：

❉ 癌细胞和正常细胞的主要区别：

❉ 癌细胞的抑制因素：

1.癌细胞在合成蛋白质时需要门冬酰胺，而与门冬酰胺共生的门冬酰胺酶却能控制癌细胞的生长。

2.包括癌细胞在内的人体每个细胞膜上存在C-Amp，能使癌细胞变成健康细胞

3.胚胎抗原CEA能触发免疫系统生成相应的抗体阻止癌细胞的生长和发展

4.人体免疫系统在保卫机体，排除异己，维持平衡方面具有强大的威力。人体免疫力主要依靠白细胞。白细胞有很多种，其中T细胞、B细胞和K细胞对人体自身癌细胞有杀灭作用。正常人体内的细胞日夜不停地进行新陈代谢，每天可形成100万白细胞

5.癌细胞要要先经过数十次的变异，努力从细胞中脱离出来，还要改变自身的形状以穿越致密的结缔组织，然后通过微血管进入到血液当中，到那里之后还可能遭到白细胞的攻击。如果能够幸存下来，则会再一次通过微血管进入到另一个器官。进入新的环境有些细胞立即就会死亡，寿命稍微长一点的可能经过数次的分裂后死亡，还有一些始终保持休眠的状态，存活率低至亿万分之一。

6.癌细胞在血行转移时会被人体固有的抗癌细胞系的NK细胞、LAK细胞、T细胞、吞噬细胞，细胞因子的INF、TNF，基因nm23等所吞噬、杀灭。

❉ 癌细胞的染色体：癌细胞的染色体常发生各种畸变，通过某些抑癌基因的丢失和另一些促癌基因的扩增，获得更多的恶性特质。癌细胞的遗传物质不稳定性是异质性的主要原因，使肿瘤内产生了大量的变异癌细胞。

❉ 癌细胞的变异：每个癌细胞在每一轮复制时，都会产生新的不同的突变，就形成了异质性的肿瘤。因此不同的肿瘤表现出免疫特性、生长速度、侵袭能力等表型方面的差异，最终导致对不同抗肿瘤药物的敏感性不同或放疗敏感性的差异。癌细胞的变异是ALK-TKI产生耐药的主要原因。

五. 癌细胞的增殖与转移

❉ 癌细胞的倍增周期：

1.小细胞癌30天，鳞癌90天，大细胞癌120天，腺癌150~180天

2.一个正常细胞变为癌细胞，不断分裂，发展为直径1cm的肿瘤大约需要10年时间，直径1立方厘米的肿瘤中，大约有10亿个癌细胞。

3.肺癌从癌细胞生成到发生症状大约需要5~10年，而早期到晚期只需要2年时间。

4.从第一个癌细胞诞生到早期癌为止，癌细胞要经过30代的子孙繁衍，而从早期癌到晚期，只要再繁衍10代即可。

5.我们体内的免疫系统可以清除大概10万个癌细胞，当癌细胞超过10万的时候，免疫系统无能为力，只能眼睁睁看着癌细胞疯长。

❉ 癌细胞的发展：

❉ 癌细胞的转移：

1.癌细胞运动是一个连续过程，癌细胞运动方式与白细胞相似，主要表现在伪足样伸展。其运动过程，先形成伪足，并通过相应的基膜上有受体与之黏附，拉动该部分的胞体前移，随后胞体收缩后细胞释放黏附受体，使整个细胞移动。

2.癌细胞在血行转移时会被人体固有的抗癌细胞系的NK细胞、LAK细胞、T细胞、吞噬细胞，细胞因子的INF、TNF，基因nm23等所吞噬、杀灭。

3.癌细胞的转移过程：癌细胞从原发肿瘤上分离脱落,与细胞基质黏附,癌细胞的运动,钻入并穿过血管壁,癌细胞在血液中的运行,又穿出血管壁,从血液中逃逸到外脏器组织中着床,血管形成，癌细胞增殖形成转移灶。

4.癌细胞的扩散和转移是人体致死的主要原因。

六.ALK的治疗方案和TKI

❉ 治疗方案：

NCCN是21家世界顶级癌症中心组成的非营利性学术联盟，其制订的《NCCN肿瘤学临床实践指南》不仅是美国肿瘤领域临床决策的标准，也已成为全球肿瘤临床实践中应用最为广泛的指南，在中国也得到了广大肿瘤医生的认可与青睐。对于癌症患者规范治疗有一定的参考价值和指导意义。

❉ 克唑替尼：

克唑替尼是一种ATP竞争性络氨酸激酶小分子抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制C-MET和ROS1等信号通路。

❉ 克唑替尼的分子结构：

❉ 克唑替尼作用机制：

克唑替尼是一种口服型小分子ATP竞争性的ALK抑制剂，它可以抑制c-Met激酶，阻断c-Met的信号转导通路，进而抑制ALK融合基因，达到抑制肿瘤细胞生长的效果。

❉ 克唑替尼的作用机制：

❉ 克唑替尼耐药机制：

ALK的耐药机制主要是发生在ALK激酶域的各种突变，新的突变基因和生成的蛋白激活新的信号通路，诱发细胞恶性增殖，则ALK-TKI产生耐药。❉ 克唑替尼耐药机制：

❉ ALK-TKI：ALK抑制剂仅以克唑替尼为代表做简介，二代和三代不再一一列举，后续会以ALK靶向药单独介绍。

❉ 结束语：