论著-骨织素抑制破骨细胞分化改善肿瘤骨转移中骨溶解的机制研究

小五

来源:觅健 2024-01-19 09:21:01

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关键词：骨转移布加替尼临床试验

--康夏 ,田浩 ,钱进 ,等.

原创本刊编辑部中华乳腺病杂志电子版 2024-01-18 09:59 发表于重庆听全文

引文格式

康夏 ,田浩 ,钱进 ,等.骨织素抑制破骨细胞分化改善肿瘤骨转移中骨溶解的机制研究 [J/ CD].中华乳腺病杂志 (电子版),2023,17(6):329-339.

DOI:10.3877 /cma. j. issn. 1674-0807.2023. 06. 002

基金项目 :

重庆市杰出青年自然科学基金资助项目 (CSTB2023NSCQ-JQX0012)

作者单位 :

400038重庆 ,陆军军医大学第一附属医院乳腺甲状腺外科 1 ;400038重庆 ,陆军军医大学高原军事医学系病理生理学教研室 2 ;610000成都 ,解放军西部战区总医院胰腺损伤与修复四川省重点实验室 3（康夏 1,2,3　田浩 1　钱进 1　高源 2　缪洪明 2　齐晓伟 1）

通信作者 :

齐晓伟 ,Email: qxw9908@ foxmail. com;缪洪明 , Email: hongmingmiao@ sina. com

　【摘要】　目的　探讨骨织素对乳腺癌等肿瘤骨转移后破骨细胞分化以及骨溶解的调控作用及可能的分子机制。方法　体内实验 :分别在 Balb / c雌性小鼠胫骨骨髓腔注射 4T1乳腺癌细胞或在 C57BL / 6雄性小鼠的胫骨骨髓腔中注射 MC-38结直肠癌细胞构建肿瘤骨转移模型 ,实验组局部注射骨织素进行干预 ,对照组注射等量溶剂。收集第 14或 21天胫骨样本切片 ,用番红固绿染色检测骨小梁情况,TRAP染色检测破骨细胞分化情况 ,显微 CT检测胫骨骨丢失情况。体外实验 :在 4T1乳腺癌细胞或 MC-38结直肠癌细胞条件培养基刺激下 ,用核因子 κB受体活化因子配体 ( RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)诱导破骨细胞分化 ,同时使用骨织素进行干预 ,TRAP染色和 TRAP ELISA法检测破骨细胞形成和 TRAP蛋白浓度 ,实时荧光定量 PCR法检测破骨分化标志物表达情况。蛋白印迹检测骨织素对 AKT蛋白磷酸化的影响。破骨细胞计数、骨密度、骨量标志物等两组比较采用 t检验 ,多组间比较采用单因素方差分析。结果　体外实验结果显示 : 4T1和 MC-38细胞条件培养基培养环境下 ,骨织素组的破骨细胞数均低于对照组 [4T1:(4. 60±1. 14)个比 (10. 60±1. 67)个, t = 6. 626, P<0. 001; MC-38:(4. 00±1. 00)个比 (10. 20±1. 92)个,t = 6. 395,P<0. 001)。体内实验显示 :小鼠乳腺癌骨转移模型中 ,骨织素组的破骨细胞面积与骨小梁面积百分比低于对照组 [14 d: (5. 55±1. 56)%比(12. 79±1. 08)%,t =7. 640,P<0. 001;21 d:(7. 21±1. 41)%比 16. 96±2. 00)%,t = 7. 966,P = 0. 001);小鼠结直肠癌骨转移模型中 ,骨织素组的破骨细胞面积与骨小梁面积百分比低于对照组 [14 d: (5. 57±0. 87)%比( 10. 69 ±0. 64)%,t = 9. 500,P<0. 001;21 d:(8. 47±0. 86)%比(15. 53±2. 81)%,t = 4. 805,P =0. 003)。实时荧光定量 PCR检测显示在骨织素组中 2个破骨分化标志物 OCSTAMP和 NFATC1的 mRNA表达水平较对照组降低 (OCSTAMP:4T1,t = 10. 018,P = 0. 001;MC-38,t = 24. 537,P< 0. 001; NFATC1: 4T1,t = 3. 356,P =0. 028;MC-38,t = 3. 377,P =0. 028)。在 4T1及 MC-38细胞条件培养基中 ,与对照组相比 ,骨织素组 AKT蛋白的磷酸化水平降低 ( t = 3. 289,P = 0. 030;t = 5. 363,P =0. 006)。AKT通路激活剂 SC79处理后会逆转骨织素抑制破骨细胞形成的能力 (4T1:F = 8. 598,P = 0. 005;MC-38:F = 9. 125,P =0. 007)。显微 CT显示:乳腺癌骨转移或结直肠癌骨转移模型中骨织素组的骨密度显著改善。结论　骨织素能通过抑制 AKT通路激活 ,减少破骨细胞形成数量 ,进而抑制乳腺癌和结直肠癌骨转移的骨溶解。

【关键词】　乳腺肿瘤;　结直肠肿瘤 ;　转移 ;　破骨细胞

骨是一些恶性肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、肺癌等常见的转移部位[1-4] 。骨转移主要分为溶骨性和成骨性两类。在乳腺癌、结直肠癌等溶骨性肿瘤转移到骨后会引起骨质破坏,导致病理性骨折、高钙血症、疼痛等并发症,严重者引起患者死亡[5-6] 。骨转移会显著降低乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者的生存质量和生存期,而针对性治疗可显著延长患者生存期[6-8] ,由此可见,积极治疗溶骨性肿瘤的骨溶解进程是改善乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者预后的关键环节和重要治疗靶点。

正常骨骼是一种新陈代谢动态平衡的器官,骨稳态由成骨细胞和破骨细胞负责调控[9-10] 。研究表明,病理状态下破骨细胞的异常激活是导致骨溶解发生的关键原因[11-13] 。破骨细胞是一种多核巨细胞,由单核/ 巨噬细胞系分化而来,多种细胞因子和通路参与了破骨细胞的分化, 其中最重要的是RANKL/ RANK 信号通路[14] 。研究证实,在乳腺癌、结直肠癌骨转移过程中破骨细胞的形成和功能异常激活是导致肿瘤骨转移后骨骼发生溶骨性改变的关键原因,通过抑制破骨细胞的形成能够有效改善肿瘤骨转移的骨溶解进展并改善患者预后[15-18] 。因此,如果有效抑制破骨细胞形成是治疗溶骨性肿瘤骨转移的研究重点。

骨织素 (osteocrin)是由 Ostn基因编码的一种分泌蛋白 ,骨骼在机械应力 (例如运动时 )下会增加骨织素的分泌 [9]。现有研究表明骨织素可调控代谢、免疫微环境 ,同时能够通过促进成骨细胞分化促进骨生长 ,是一种重要的调控因子 [19]。但是目前尚不清楚其对破骨细胞是否存在调控作用以及是否能够改善肿瘤骨转移后的骨溶解 ,研究骨织素对骨转移后破骨细胞异常激活以及骨破坏的调控作用有助于阐释肿瘤骨转移的发病机制 ,寻找新的潜在治疗靶点。同时 ,由于骨织素的产生与运动密切相关[20-21] ,研究骨织素对骨转移瘤后骨溶解的影响也能从侧面阐释运动抗癌的潜在分子机制。鉴于此 ,笔者探索了骨织素对破骨细胞形成的影响以及对乳腺癌和结直肠癌骨转移后骨量丢失的调控作用及其可能的分子机制。

材料与方法

一、主要材料和试剂

4T1乳腺癌细胞系和 MC-38结直肠癌细胞系为本实验室自有 ;6 ~ 8周 Balb / c雌性小鼠或 C57BL / 6雄性小鼠购自恩斯维尔生物科技有限公司;DMEM、 α-MEM培养基购自 Hyclone公司 ,胎牛血清购自 GIBICO公司 ; cDNA逆转录试剂盒和 SYBR Green PCR试剂盒购自 TAKARA公司 ;番红 -固绿染色剂购自索莱宝公司 ;TRAP染色试剂盒购自 Wako公司;磷酸化 AKT抗体、总 AKT抗体、β-actin抗体购自 Affinity公司 ; RANKL小鼠重组蛋白、巨噬细胞集落刺激因子 ( macrophage colonystimulating factor, M-CSF)小鼠重组蛋白购自 R&D公司、骨织素小鼠重组蛋白购自 GL公司。

二、细胞培养

4T1乳腺癌细胞系和 MC-38结直肠癌细胞系接种在完全培养基 (含 10%胎牛血清和 1%青霉素 -链霉素的 DMEM培养基 ),置于37 ℃、5% CO 2细胞培养箱中培养 ,每 2~3 d换液。原代破骨前体细胞在含 10%胎牛血清和 1%青霉素 -链霉素的 α-MEM培养基中培养。在体外诱导成破骨细胞分化时 ,加入核因子 κB配体的受体激活因子 (receptor activator of nuclear factor-κ b ligand,RANKL)重组蛋白 (50 ng /ml)和 M-CSF重组蛋白 (20 ng /ml),其中部分实验用骨织素重组蛋白 (1 μmol /L)以及 AKT通路激动剂 SC79(4 ng /ml)处理48 h。收集肿瘤细胞条件培养基时 ,待肿瘤细胞汇合度约 80%时,弃掉完全培养基,加入 DMEM继续培养 12 h,然后收集上清液 ,500×g离心去掉细胞及碎屑 ,将上清转入新的 50 ml离心管中保存。

三、实验方法

1.构建骨织素干预的小鼠乳腺癌或结直肠癌骨转移模型

为明确骨织素对体内乳腺癌和结直肠癌骨转移的破骨细胞形成能力的影响 ,我们通过在小鼠胫骨骨髓腔中注射 4T1细胞系或 MC-38细胞系分别构建乳腺癌和结直肠癌骨转移模型。实验分为对照组和骨织素干预组 ,每组 3~4只。将小鼠用 0. 5%戊巴比妥钠麻醉后 ,仰卧于操作台上 ,消毒双侧后腿膝关节 ,去除表面毛发 ,然后将膝关节屈曲 ,用胰岛素针垂直胫骨平台 ,沿胫骨纵轴仔细钻入到胫骨骨骺下方 ,注射 50万个 4T1乳腺癌细胞或 MC-38结直肠癌细胞 ,然后注射 2 μg骨织素到骨髓腔中 ,对照组注射等量溶剂。收集第 14天和第 21天样本 ,通过免疫组织化学染色观察骨小梁和破骨细胞形成情况。

2.番红固绿染色

通过免疫组织化学染色检测骨织素对结直肠癌骨转移模型骨量丢失的影响。将指定时间点的小鼠胫骨取出后用 4%多聚甲醛固定 48 h,然后用 EDTA脱钙液脱钙完全 ,制作石蜡切片。用二甲苯脱蜡 ,并用酒精梯度复水后 ,将样本置于番红溶液浸泡 3 min,然后用固绿溶液浸泡 10 s最后用 1%醋酸溶液分色 ,封片镜下观察骨小梁破坏情况。

3.组织切片和细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)染色

切片常规脱蜡、复水后 ,按照 TRAP染色试剂盒说明书染色。滴加适量 TRAP染色液 ,在 37 ℃烘箱孵育 30 min,洗去多余染料 ,在显微镜下观察拍照观察体内破骨细胞形成情况。将破骨前体细胞在 4T1或 MC38细胞系的条件培养基中进行培养 ,然后诱导成破骨分化并加入骨织素进行干预 ,体外染色破骨细胞时 ,吸弃培养基 ,用 4%多聚甲醛固定 10 min,然后用甲醇 /丙酮 (50%,v/v)在室温固定1 min。然后 ,滴加 250 μl的 TRAP染色液 ,在 37 ℃烘箱孵育 30 min,洗去多余染料 ,在显微镜下观察拍照。

4.实时荧光定量 PCR

在样本中加入 1 ml Trizol裂解液 ;每管加入氯仿,剧烈震荡 30 s;离心后吸取上层水相液体 ,加入等体积预冷的异丙醇溶液 ,轻轻颠倒混匀 30 s;离心后去上清 ,加入预冷的 75%酒精 ;离心后去除上清 ,加入适量 DEPC水,溶解 RNA沉淀 ;使用 Takara逆转录试剂盒 ,使用 20 μl体系 :其中 4 μl 5 ×PrimeScript Buffer、1 μl RT Enzyme Mix、相应的 RNA体积、DEPC水补齐总体积至 20 μl;放入 PCR仪,运行程序 :37℃ 15min,85℃ 5s,程序结束后 4℃保存。引物序列见表1。使用 Takara TB Green试剂盒,每个孔加样体系如下 :TB Green荧光染料 10 μl,正义或反义引物 0.8 μl,互补 DNA(cDNA)0. 5 μl, DEPC水补齐至20 μl。溶解曲线的反应条件是 :从 65 ℃开始 ,5 s,然后读取相应数值 ,每个循环温度升高 0.5 ℃,最终达到 95 ℃结束 ;检测完成后 ,根据对应基因的循环数进行数据分析 ,检测破骨细胞分化基因的表达差异。

5.蛋白印迹检测 (Western blot)

既往研究表明 :骨织素与 AKT通路关系密切而 AKT通路激活会促进破骨细胞形成 [22-23] ,因此采用蛋白印迹法检测骨织素是否能抑制 AKT通路。用 RIPA裂解液提取总蛋白 ,使用 SDS-PAGE胶分离蛋白,在 80 V处理 2 h,然后以 80 V恒压转膜 1.5 h至 PVDF膜,5% BSA封闭 1 h,加入一抗磷酸化 AKT抗体 (1 ∶1 000)、AKT抗体 (1 ∶ 1 000)和 β-actin (1 ∶ 1000)孵育 ,4 ℃过夜。洗去多余一抗 ,加入山羊抗小鼠 IgG(1 ∶ 2000)抗体 ,室温封闭 1 h,显影剂显影曝光。检测骨织素对 AKT蛋白活化情况的影响。

6.显微 CT检测

采用 Skyscan1174型显微 CT的 Scaner软件对各样本进行扫描。电压 50 kV,电流 800 μA,以 12 μm扫描分辨率对小鼠胫骨进行扫描。将胫骨的生长板最底端下 0.1 mm定为扫描参考线 ,将此平面下的 50张连续切片 ,即厚度约为 0.6 mm的区域设定为三维重建感兴趣区域 ,用 N-Recon软件进行三维图像重建 ,用 CT-AN软件进行三维分析 ,并进行感兴趣区域骨密度测定。

五、统计学方法

应用 SPSS 26. 0统计软件进行数据分析。破骨细胞计数、骨密度、骨量标志物等计量资料满足正态分布 ,以 x±s表示 ,两组比较采用 t检验 ,多组间比较采用单因素方差分析。以 P < 0. 050为差异有统计学意义。

结　　果

一、骨织素体外抑制乳腺癌和结直肠癌环境中的破骨细胞形成

TRAP染色显示在 4T1乳腺癌细胞系或 MC-38结直肠癌细胞系的条件培养基培养环境中 ,骨织素组破骨细胞形成能力较对照组明显减弱 ( t =6. 626、6. 395,P均<0. 001)(表 2,图1)。

TRAP活性检测结果显示骨织素组细胞中的 TRAP蛋白表达显著低于对照组 (4T1:t = 7. 843,P =0. 001;MC-38:t = 11. 142,P = 0. 001;表3)。实时荧光定量 PCR检测显示 2个经典的破骨分化标志物 OCSTAMP和 NFATC1的 mRNA表达水平在骨织素组中显著下降 ,具体数据见表4。这表明在体外模拟的乳腺癌和结直肠癌肿瘤微环境中 ,骨织素可显著抑制破骨细胞分化能力 ,减少破骨细胞数量。

二、骨织素体内抑制乳腺癌和结直肠癌骨转移后的破骨细胞形成

TRAP染色显示在骨织素干预后第 14天和第 21天后 ,乳腺癌骨转移模型和结直肠癌骨转移模型中的破骨细胞形成能力低于对照组 ,具体数据见表 5 ~ 6,TRAP染色情况见图2 ~ 3。

三、骨织素通过抑制 AKT通路激活抑制破骨细胞形成

蛋白印迹检测结果显示 :在 4T1细胞条件培养基诱导成破骨分化时 ,与溶剂处理相比 ,骨织素干预会显著抑制细胞中 AKT蛋白的磷酸化水平 ( t =3. 289,P = 0. 030);在 MC-38细胞条件培养基环境中也有类似结果 (t = 5. 363,P = 0. 006) (表7、图 4),提示骨织素会影响肿瘤微环境破骨分化过程中 AKT蛋白的激活。

虽然骨织素会显著抑制乳腺癌和结直肠癌肿瘤细胞系条件培养基环境中的破骨细胞形成 ,但使用 AKT通路激活剂 SC79处理后会逆转骨织素抑制破骨细胞形成的能力 (图 5和表8)。

四、骨织素抑制肿瘤骨转移后的骨溶解

番红固绿染色显示在注射 4T1乳腺癌细胞的骨转移模型中 ,骨织素组的骨小梁面积高于对照组 (14 d:t = -6. 670,P = 0. 001;21 d: t = -4. 097, P =0. 006)(图 6和表9)。显微 CT检测显示在骨转移模型第 21天时 ,骨织素组的骨密度高于对照组 ( t = -3. 837,P = 0. 019) (图 7,表 10),同时骨小梁检测指标 (骨小梁厚度、骨小梁数目以及骨体积分数 )均显著增高 ,具体数据见表10。

与乳腺癌骨转移模型类似 ,在 MC-38结直肠癌细胞后小鼠骨转移模型中 ,骨织素可显著促进骨小梁面积 (图 8和表 11),同时提高骨小梁密度 (图 9和表12)。这些结果提示骨织素可抑制乳腺癌骨转移和结直肠癌骨转移后的骨丢失。

讨　　论

本研究发现骨织素可直接抑制体内和体外破骨细胞形成。在乳腺癌和结直肠癌转移过程中 ,外源性给予骨织素可有效抑制骨溶解进展 ,改善肿瘤骨转移过程中的骨破坏程度。机制上 ,AKT通路在骨织素抑制破骨细胞分化过程中扮演了重要作用。

骨稳态是骨形成和骨溶解的动态平衡过程 ,任何一方增强或削弱都会引起骨稳态被打破 ,进而出现骨硬化或骨破坏。既往研究发现骨织素能够正向调控骨形成过程,诱导成骨细胞分化或骨细胞的树突生长[21-22] , 进而发挥促进骨生长的生物功能[20,23]。本研究进一步发现骨织素在体内亦可抑制破骨细胞的形成,骨织素不仅调控骨形成过程,而且可以通过直接抑制破骨细胞分化进而抑制骨溶解过程,从成骨和破骨两方面保护骨组织流失,促进骨量增加。由此可见,骨织素是一种正面维持骨量的功能比较强大的活性因子,对于成骨占优势的生理过程十分重要。

在肿瘤微环境中,溶骨性肿瘤细胞会通过分泌IL-11、趋化因子等分泌因子从依赖性RANKL 和非依赖性RANK 两种途径加强破骨细胞分化,其调控方式更为复杂[24-25] 。因此,笔者在本研究中加入肿瘤细胞条件培养基以明确骨织素在肿瘤微环境的非常规条件下是否能够有效抑制破骨细胞分化,结果显示无论是体内还是体外,骨织素均能抑制多种肿瘤微环境中的破骨细胞形成。这提示骨织素即使在复杂环境中也能有效抑制破骨细胞的形成,起到缓解骨溶解的作用,说明其具有作为肿瘤骨转移治疗药物的潜力。

研究证实AKT 通路是促进破骨细胞分化的关键通路之一[26-28] 。笔者发现骨织素可显著抑制AKT的磷酸化,激活AKT 通路会拮抗骨织素对破骨细胞形成的抑制作用。虽然本研究不能完全排除骨织素对破骨细胞的抑制作用也可能受到其他通路的调控,但AKT 通路在骨织素调控破骨细胞中的作用是十分显著的。文献报道除AKT 通路外,NF-κB 通路和MAPK 通路也是调控破骨细胞分化的重要通路[29-30] ,尤其是 MAPK通路与 AKT通路存在交互关系 [31] ,因此 ,在后续研究中我们将继续通过蛋白组、转录组等多组学技术继续探索骨织素的下游通路 ,以便进一步了解骨织素调控破骨细胞的胞内分子网络。

本研究仍存在一些局限性 ,例如研究证实了骨织素对破骨细胞的抑制作用 ,但没有进一步检测其是否可以直接作用于肿瘤细胞 ,是否能从调整微环境及直接调控肿瘤细胞两方面起到抑制肿瘤骨转移的作用等。但是 ,本研究通过构建乳腺癌和结直肠癌骨转移模型验证了骨织素对骨溶解的保护作用 ,其结果是对既往骨织素促进成骨功能的补充。不仅如此 ,骨织素是一种机械应力性的分泌因子 ,与运动密切相关 ,而运动是预防和改善骨质疏松等破骨细胞异常激活类疾病的有效干预手段。本研究也从一定程度上阐释了运动缓解骨溶解一类疾病的细胞分子机制 ,证实了骨织素在此类疾病中的潜在治疗价值,其有望成为新的抗癌药物靶点。

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