002、如何检测ALK融合突变呢？

        1.IHC免疫组化法就是平常病理诊断用到的免疫组化技术，简单的说就是检查不同指标时需要使用对应的抗体将细胞染色，根据染色强度评估阴/阳性。目前可选择的ALK抗体有4种包括ALK1、5A4、D5F3 以及 1A4，其中非Ventana D5F3抗体因为特异性略低仅适合用于初筛，且实际临床应用也较少。Ventana D5F3抗体的灵敏度和特异性能够达到95%-100%，专家共识推荐优先使用。

2.荧光原位杂交FISH被认为是融合/重排突变检测的金标准，原理简单来说就是用一个红色标签标记ALK基因其他位置，另外一个绿色标签标记ALK基因20外显子，当两个标签重叠时荧光下观察到黄色信号（红色绿色重叠对外显示黄色）说明未发生ALK基因断裂即没有ALK融合突变，而当两个标签分开时则说明ALK基因发生断裂即可能有ALK融合突变，理论上FISH法可检测所有ALK融合突变类型，如下所示。

3.荧光定量PCR（RT-PCR）是一种快速简便的检测方式，其利用DNA/RNA复制原理，用特异性的上/下游引物将目标片段（比如ALK基因中某一段）特定选中并按照指数倍复制扩增，根据产生的荧光信号判读结果。

仍以E13:A20融合类型为例，因为有文献报道过这个融合类型，所以可设计特定识别这个突变的引物A和B，然后在检测时如果发生该融合，特定的上下游引物A和B会结合在融合后的基因片段两端。好比AB两个警察只负责抓捕叫“E13 : A20”的犯人，一旦发现他出现就会固定一头一尾的逮住他，但对别的犯人（融合类型）就会自由放行。引物成功结合后就执行循环指数倍复制扩增并产生荧光信号，当复制扩增到足以探测到的量即表明存在E13:A20融合突变，如下：

4.二代测序NGS是近年来兴起的一种检测技术，因其通量大、检测类型全面的特点能更好满足临床需要，所以推广迅速并成为现在最常用的肿瘤基因检测技术。二代测序的原理较为复杂，在这不做过多赘述，简单描述即通过二代测序检测可以明确待检测基因全长的情况，而并非其中某一个片段，因此无论是待检测基因是发生点突变、融合/重排等都可以检测。

是不是还有点不太理解？那还是用高铁列车的例子，待检测基因还是以ALK基因为例，二代测序就相当于每个车厢的乘务员开始从头到尾每个座位查票，坐错座位的（点突变）、多了个座位的（插入突变）、车厢接错了的（融合/重排突变）一个都跑不了，只要发生了这些问题都能查出来。