介绍下肿瘤分子检测都有哪些，与基因检测有何不同？

现在医疗中的靶向药物越来越多，比如肺癌EGFR一代药物吉非替尼、厄洛替尼、艾克替尼等；二代药物阿法替尼、三代药物AZD9291；ALK一代药物克唑替尼；二代的药物色瑞替尼、阿雷替尼（艾乐替尼）等等。那么使用这些药物之前为什么有时是做免疫组化，有时去做基因检测呢？

当前肿瘤治疗技术正在向基因治疗方面过渡，对于生命科学中DNA（脱氧核糖核酸）是用来承载遗传信息，DNA转录成为RNA（核糖核酸），RNA再翻译成为蛋白质（促进人体思考和活动），常见的分子检测技术，基本上就是检测这三种生物大分子的序列信息、表达水平等。下面对免疫组化和基因检测做了简单介绍。

由于RNA容易降解，不稳定，检测比较难完成；优点是可以发现新的融合基因，对RNA进行检测多在实验室研究阶段。总之现在成熟的检测技术，基因测序是对DNA信息进行测定，免疫组化（分子检测的一种）是对蛋白质水平进行测定。分子检测可以对肿瘤分子的生物标志物进行完整图谱分析；基因检测主要是针对DNA的突变。对比看分子检测更全面，基因检测容易对部分肿瘤突变有遗漏。

免疫组化检查

免疫组化，是应用免疫学的原理，使用特异性的抗体检测目标组织样本中某一类型蛋白水平的技术，免疫组化检测的只能是组织样本（比如说：活检穿刺或手术切除的），如果目标蛋白表达量高表现出较为深的颗粒性着色。这个技术已经非常成熟。医生对一个肿瘤进行定性，要检测一系列蛋白的表达情况，根据这些来对肿瘤进行定性。

免疫组化的结果解读有几种解读标准：

如果是3个加号（+）认为是强阳性，

一个加号（+）和一个减号（-）一般是阴性，

介于二者之间的两个加号（+）认为是弱阳，

弱阳性有时需要再次使用FISH进行验证。

免疫组化主要检查组织样本的某些蛋白表达水平，主要用于肿瘤的分型。也可根据蛋白表达量，来判断某些靶向药物的疗效。比如检查Her2的表达来指导曲妥珠单抗（赫赛汀，国内已经上市），检查EGFR表达指导吉非替尼（易瑞沙，中国已经上市）和厄洛替尼（特罗凯，中国已经上市）的使用、检查MET高表达来看卡博替尼（国内还未批准上市）的使用,检查PD-L1表达的高低来看派姆单抗（国内还未批准上市）的使用等。

但也有某些蛋白表达水平与靶点药物疗效没有确凿关系的。如血管内皮生长因子（VEGF）的表达量高低，并不能完全与贝伐单抗（安维汀，中国已经上市）的疗效一致。血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达量并不能完全判断靶向药物的疗效。很多时候表达量较低，也是可以使用靶向药物的，如阿昔替尼（英立达，国内已经上市）、阿帕替尼（艾坦）等。

原位免疫荧光杂交FSIH检查

原位免疫荧光杂交用来判断基因的融合，基因的断裂和重排，另外如存在染色体拷贝数增多也是可以使用FISH的，主要用于基因检测。

FISH的原理是，使用红绿两种荧光探针，分别标记某个基因的两端，如果一个基因的中间没有发生断裂，则红色荧光和绿色荧光靠近，表现的是一种黄色荧光信号，或者红绿两种荧光靠的很近。如果基因发生了断裂，如ALK与EML4基因融合，ALK基因中间断裂，则分别与ALK基因两端结合的红色荧光探针和绿色荧光探针分开，通过计数出现荧光分离的细胞数目，即可判断是否发生了基因断裂。

FISH的检测方法已经成熟，但是操作比较复杂，涉及较多的人工，而且检测一个基因或染色体的重排都在3000元左右。不管是ALK基因的融合，还是脑胶质瘤的1p19q染色体重排，操作流程和价格都是类似的。

一代基因测序技术（虽然是一代但是准确性特别高）

一代测序技术目前仪器和技术比较成熟，特点是一次性可以检测800-1000个碱基的长度，准确度较好，完成一个测序反应的价格在20元左右。

但是缺点是通量低，如果是一次性检测几百个基因，几万个基因，这就该使用二代基因检测技术了，尤其是肿瘤具有异质性的特点，需要一次性对肿瘤组织里提取的DNA进行几千次、上万次的测序，对基因突变频率给出相应的数值，这就是不是一代检测技术可以完成的了，只能使用二代基因检测技术。一代的技术优势就是成熟和稳定，但是需要知道的是，一代基因检测技术不能检测基因突变频率，而且由于肿瘤存在异质性，容易漏检低频的基因突变。

二代基因检测技术

二代基因检测技术也称之为高通量测序技术，主要原理是通过超声波将DNA达成100-200bp的片段，然后通过一定的处理将每一个片段扩增成一个分子簇，再使用相应的技术检测每个分子簇合成一个碱基时释放的荧光信号，或者是电化学信号。

可以实现检测速度快，目前较为新的检测技术，可以将人的基因组信息全部测完，价格已经降低为1万元以下。

但是需要注意的是，人的全基因组测序是检测人的正常细胞的DNA序列信息，但是往往需要很多次的反复检查。

由于肿瘤具有异质性的特点，对肿瘤组织检测深度只有几十次是不够的，有时要测很多很多次的反复检查。

目前有二代基因检测技术一个劣势是，对血液里肿瘤细胞裂解释放的DNA检测的灵敏度不高，是血液里肿瘤细胞裂解释放的DNA浓度很低，只占1%左右，大部分是正常细胞裂解释放的DNA，而且二代基因检测技术还有测序深度越高，出现测序错误的问题，这个并不能通过单独加大测序次数来解决。

各种PCR检测技术技术

PCR技术也比较常见地用在肿瘤分子诊断领域。经常容易看到的一些EGFR的突变信息是使用QPCR（荧光定量PCR）检测的。QPCR的结果是一些扩增曲线，通过设置阴性对照，阳性对照来判断是否存在特定的突变位点。QPCR被称为是第二代PCR技术，第一代PCR是比较传统的PCR扩增技术，这个是获得了诺贝尔奖的一项发明。

ARMS-PCR的全称是突变扩增系统，国内一家公司具有一些专利，而且还有一些试剂盒获批对相应的突变基因位点进行检测，ARMS-PCR，比传统的PCR技术灵敏度和特异性会高很多，但其也是只能检测有限基因的已知位点。

ddPCR（微滴式数字PCR）是第三代PCR技术，原理是先将模板分子稀释，然后将每一个模板包裹到一个液滴里面（油包水），而且是每个液体只包裹了一个模板DNA分子，通过反应，液滴的DNA分子被放大了百万倍以上。通过对这些液滴进行检测可知道哪些液滴里有DNA模板分子，哪些里是没有的，进而实现绝对的定量。进行可以做到极为高的灵敏度和准确度，也就是几万个分子里有一个突变的分子DNA，也可以检测出来。

这种方法比较适合对血液样本的已知基因突变位点进行检测，如EGFR基因的T790M（使用AZD9291前要检查这个），ALK基因克唑替尼（赛可瑞，国内已经上市）耐药后出现的守门基因突变等，数字PCR的原理还是PCR，检测的是基因的已知突变位点，但是它的极高的灵敏度是特点，比较适合血液样本检测EGFR、ALK的那些二次突变位点，进而知道后续的用药。

没有任何一种检测技术是完美的，俗话就是不能既让马儿跑又让马儿不吃草是不可能的。

对比下几种分子检测技术的灵敏度：

Sanger（一代测序）的灵敏度是10%，

二代基因检测技术的灵敏度是2%，

普通数字PCR的灵敏度是1%，

ArmsPCR的灵敏度在0.1%，

数字PCR的灵敏度可以达到0.01%或者更低。

对于一个患者来说：如果有组织样本，自然优先使用二代测序，因为癌细胞就在哪里，肯定可以测到突变信息，同时测几十个基因，几百个基因价格也不是很高，基本上能接受，由于肿瘤的异质性，以及低频基因突变的存在，最重要的是组织样本很珍贵，用了以后再取就得又让患者受苦，所以最好还是测的全面一些。

对于血液样本，即晚期肿瘤患者，或者不适宜取组织样本的患者。抽血检测肿瘤细胞裂解释放的DNA，这个时候就存在一定的取舍，因为ctDNA的浓度较低，二代检测技术不一定都能测到。

ARMS-PCR等技术只能检测有限基因的已知位点，而且对于一些基因突变的位置信息还检测不到，这就需要综合来考虑，即根据患者的治疗过程，选择合适的检测技术，如果就是只想检测EGFR的T790M，或者ALK的守门基因耐药突变，那就是用ARMS-PCR，或者数字PCR；如果根本不知道是什么导致的耐药，甚至什么基因都不清楚，那就使用二代基因测序。